strukturální vhled do komplexu FtsQ/FtsB/FtsL, klíčová složka Divisome

intermolekulární interakce FtsQ a FtsB

předchozí studie ukázaly, že periplazmatický subkomplex FtsB a FtsL může být rekonstituován nahrazením membránových oblastí obou proteinů opačně nabitými, rozpustnými sloučeninami.svitky (E5 a K5 na obr. 1A) 20,21,22. Pomocí této techniky byl stabilní binární komplex (FtsBL) sestávající z FtsB a FtsL rekonstituován koexprimací e5-FtsB25-103 a k5–FtsL64-121 v buňkách E.coli (obr. 1A a doplňkový obr. S2). Ternární komplex (FtsQBL) sestávající z FtsQ, e5-FtsB a k5-FtsL byl rekonstituován smícháním mokré buněčné pelety obsahující nadměrně exprimovanou FtsQ50-276 a buněčné pelety obsahující nadměrně exprimovanou e5-FtsB25-103 a k5-FtsL64-121. Komplexy FtsBL a FtsQBL byly společně eluovány z afinitní kolony a společně migrovány na sloupcích s vyloučením velikosti (obr. 1B,C). Byl vytvořen stabilní komplex FtsQ50–276-FtsB25–103 (obr. 1B), ale FtsQ neměl žádnou vazebnou afinitu s k5-FtsL64-121 v nepřítomnosti e5-FtsB25-103 (údaje nejsou uvedeny), v souladu s předchozí studií20. Pro přesné zmapování vazebné oblasti mezi FtsQ a FtsB byly navrženy dva konstrukty (FtsB25-60 a FtsB61-103)se zkrácenými n-nebo C-terminálními oblastmi FtsB25-103 a jejich interakce s FtsQ50–276 byly zkoumány v experimentu s biovrstvou interferometrií (BLI) (obr. 1D). FtsQ50-276 vázaný na komplex FtsB25-103 s disociační konstantou (KD) 0,67 µM (obr. 1D). Mezi dvěma konstrukty FtsB (FtsB25–60 a FtsB61–103) byla stabilní pouze vazba FtsB61–103 na FtsQ50–276 (KD = 0,9 µM), což naznačuje, že C-koncová oblast FtsB (primárně zbytky 61-103) přispívá hlavně k vazbě FtsQ (obr. 1D), v souladu s předchozím výsledkem, že C-konec FtsB je nezbytný pro interakci s FtsQ25. Ačkoli jiná předchozí studie naznačovala, že membrána-proximální oblast FtsQ je dalším interakčním hotspotem pro vazbu Ftsb23, stabilní vazba FtsQ50-276 s FtsB25-60 nebyla v našem experimentu pozorována (obr. 1D).

Obrázek 1

mapování vazebné oblasti FtsQ-FtsB-FtsL. (A) doménová Architektura FtsQ, FtsB a FtsL. Konstrukce jsou označeny šedými čarami a rekonstituce ftsb a FtsL pomocí E5 – a K5-cívky jsou zobrazeny. B) SDS-PAGE komplexů FtsQ50–276, FtsQ50–276/FtsB25–103 a ftsq50–276/e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (FtsQBL). Gely SDS-PAGE byly vizualizovány pomocí Coomassie Blue. (C) ftsqbl heterohexamer (3 mg / mL, Světle zelená čára), ftsqbl heterotrimer (3 mg/mL, červená čára), FtsQB (10 mg/mL, modrá čára) a FtsQ (10 mg/mL, černá čára) byly analyzovány pomocí SEC-MALS. Tlustá čára představuje měřenou molekulovou hmotnost. D) reprezentativní bli testy FtsQ50-276 s FtsB25-103, FtsB61-103 a FtsB25-60. Bli sensorgramy s různými koncentracemi analytů jsou označeny různými barvami. Rovnovážná analýza a vypočtené KD jsou zobrazeny pro každou konstrukci na pravých panelech. Pokusy se opakovaly třikrát.

krystalová struktura komplexu ftsq-FtsB

abychom získali další vhled do strukturální organizace komplexu FtsQB, určili jsme strukturu rozlišení 2.9-Å FtsQ50-276 vázanou na FtsB25–103 (obr. 2, Doplňkový Obr. S3 a tabulka 1). Mapa elektronové hustoty reziduí 25-60 nebyla pozorována pro FtsB25-103, zatímco bylo zjištěno, že téměř všechny sekvence FtsQ50–276 jsou uspořádány s výjimkou N-A C-terminálních flexibilních oblastí (rezidua 50-52 a 262-276; obr. 2A a doplňkový obr. Galaxie). Shodně, mapa elektronové hustoty Ftsb N-konce (rezidua 22-63) nebyla pozorována pro FtsB v krystalové struktuře komplexu FtsQB, který byl nedávno hlášen jinou skupinou26. Jednou z možností, pokud jde o nedostatek elektronové hustoty, je to, že membrána-proximální šroubovice je neuspořádaná v krystalu komplexu FtsQB; krystalová struktura 30 juxta-membránových aminokyselin FtsB však ukázala, že tvoří kanonickou vinutou cívku27, proto jsme tuto možnost vyloučili. Další možností je, že membrána-proximální šroubovice se během čištění a krystalizace automaticky štěpí, takže zbývající konstrukt (FtsQ50-276-FtsB61-103) snadno krystalizuje. Vzhledem k tomu, že předchozí simulace molekulární dynamiky komplexu FtsQBL ukázaly, že centrální část FtsB kolem zbytku Leu60 má spirálu-break28, předpovídali jsme, že centrální část FtsB kolem Leu60 je náchylná k proteolýze.

Obrázek 2

celková struktura komplexu FtsQ50–276/FtsB25–103. (A) stereofonní pásové diagramy komplexu FtsQB. Mapa elektronové hustoty zbytků 61-95 byla pozorována pouze pro FtsB25-103. Každý řetězec je zobrazen v jiné barvě. (B, C)zvětšený stereofonní pohled zobrazující podrobnosti o interakci na rozhraní FtsQ a FtsB. Každý řetězec je zobrazen v jiné barvě.

Tabulka 1 Sběr dat a upřesnění statistiky.

celková struktura FtsQ50-276 se skládá ze dvou domén, α a β, a β-doména je zodpovědná za vazbu FtsB25–103 (obr. 2A). Povrchová plocha přístupná rozpouštědlům zakopaná na rozhraní mezi FtsQ a FtsB byla 1330 Å2, což je přibližně 20% povrchové plochy monomeru FtsQ. Kromě toho je přibližně 50% nehydrogenních atomů v rozhraní mezi FtsQ a FtsB polární, jak je naznačeno výpočty povrchové plochy proximální isovelocity 29. Sekvence FtsB (zbytky 61-95)se skládá do jedné α-šroubovice (α3) a jednoho β-řetězce (β1; obr. 2A). Motiv α-šroubovice-turn-β-pramene začíná α-šroubovice (zbytky 64-75), následuje Zauzlená smyčka (zbytky 76-82), krátký β-řetězec (zbytky 83-85) a další koncová smyčka (zbytky 86-95; obr. 2C); dvě zalomené smyčky obsahují dva zbytky prolinu (Pro80 a Pro89; obr. 2C). Zajímavé je, že šroubovice ftsq α5 přijímá zalomený tvar začleněním Pro228 do středu a tento tvar se zdá být rozhodující pro jeho rozsáhlé kontakty s FtsB. Když Tyr předchází Pro v aminokyselinové sekvenci, zvyšuje tendenci zbytku Pro přijímat konformaci cis30; zbytek Pro228 ftsq však přijímá trans konformaci (obr. 2C).

vazebné režimy FtsQ v komplexu s FtsB

ačkoli předchozí hmotnostní spektrometrická analýza pomocí foto zesíťování ukázala, že C-koncové oblasti FtsQ a FtsB jsou rozhodujícími interakčními hotspoty, podrobné interakce navržené hmotnostní spektrometrickou analýzou byly zcela odlišné od interakcí pozorovaných v naší krystalové struktuře (obr. 2). Na základě hmotnostní spektrometrické analýzy bylo navrženo, že C-konec FtsB kolem zbytku Met77 tvoří β-listovou interakci s C-koncovým řetězcem FtsQ kolem Gly255 residue23. Na rozdíl od těchto údajů naše krystalová struktura ukázala, že oblast kolem met77 zbytku FtsB netvořila sekundární strukturu a směr jejího postranního řetězce je opačný k očekávané vazebné oblasti FtsQ (obr. 2C). V naší krystalové struktuře C-koncová oblast FtsB (zbytky 61-103) intenzivně interaguje s β-doménou FtsQ a hlavně přispívá k vazbě FtsQ. Zalomená smyčka mezi α-šroubovice (zbytky 64-75) a β-řetězce (zbytky 83-85) obtéká kolem tyr248 zbytek FtsQ (obr. 2B). Pro stabilizaci konformace zalomené smyčky tvoří čtyři zbytky FtsB (Glu68, Arg72, Arg79 a Glu82)shluk s rozsáhlými sítěmi solných můstků (obr. 3A). FtsB Glu68 tvoří solné mosty s Arg72 (2.8 Å) a Arg79 (2.8 Å), zatímco Arg72 tvoří solný most s Glu82 (2.8 Å a 3.0 Å; obr. 3A); atom Arg72 NH2 tvoří jednu další interakci s atomem Glu68 OE2 (2.8 Å; obr. 3A). Shluk solných můstků FtsB je rozhodující při tvorbě vodíkové vazby (2.7 Å) mezi atomem kyslíku FtsQ Tyr248 a atomem NH1 FtsB Arg72 (obr. 3A). Dále FtsB Glu69 tvoří solný most s FtsQ Arg196 (2.3 Å; obr. 3A). Zajímavé je, že β-řetězec FtsB vytváří spojitý β-list s ftsq antiparalelním stohováním s β12(obr. 2C). FtsB Phe84 vytváří úzké kontakty s Ftsq Tyr248, zatímco Tyr85 sídlí v těsné blízkosti hydrofobního jádra ftsq β-domény sestávající z Leu226, Leu230, Val254 a Trp256 (obr. 2B). FtsB Leu87 také vytváří rozsáhlé kontakty s FtsQ Leu226 a alifatickou částí Arg222 (obr. 2C).

obrázek 3

molekulární interakce komplexu FtsQB v detailu. (A) zvětšené pohledy zobrazující podrobné interakce na rozhraní FtsQ a FtsB. Jsou zobrazeny pásové diagramy FtsB a povrchové diagramy FtsQ. Červené povrchy označují 100% konzervované zbytky FtsQ (Doplňkový obr. S2). B) reprezentativní bli testy FTSQ-FtsBL komplexu WT a mutantů (FtsQ Y248A, FtsB E68A, FtsB E69R, FtsB R72E a FtsB E82R). Bli sensorgramy s různými koncentracemi analytů jsou označeny různými barvami. Rovnovážná analýza a vypočtené KD jsou zobrazeny pro každou konstrukci na pravých panelech.

pro vyhodnocení příspěvků interfaciálních zbytků komplexu FtsQB byly mutovány interfaciální konzervované zbytky FtsQ (Tyr248) a FtsB (Glu68, Glu69, Arg72 a Glu82) a jejich interakce byly zkoumány pomocí BLI. Vazebné afinity mezi FtsQ a FtsB byly měřeny imobilizací divokého typu (WT) nebo mutantů GST-e5-FtsB v komplexu s k5-FtsL. Podle očekávání vedla mutace mezifázových reziduí k velkému snížení afinity ve srovnání s WT (KD = 0,24 µM). Hodnota KD mutantu Y248A nemohla být měřena kvůli slabé vazbě, zatímco E68A snížila afinitu přibližně 10krát (obr. 3B). Mutace obrácení náboje E69R, R72E a E82R FtsB téměř zrušily vazbu na FtsQ (obr. 3B). To zdůrazňuje roli Ftsq Tyr248 a motivu ftsb α-helix-turn-β-strand jako afinitních determinantů.

rozhraní FtsQ a FtsB in vivo

pro ověření vazby in vitro periplazmatických oblastí FtsB a FtsQ jsme provedli bakteriální dvouhybridní test založený na cyklické signalizační kaskádě AMP31. Vzhledem k tomu, že N-konec T18 nebo T25 fúzovaného FTS proteinu byl toxický pro E. coli a má určitý stupeň nestability, konstruovali jsme C-konec-fúzované FTS proteiny (T25-FtsQ, T18-FtsB)18. Reportážní kmen E. coli BTH101 byl souběžně transformován s párem indikovaných plazmidů a účinnost vazby byla stanovena testem β-galaktosidázy (obr. 4A). Jak je znázorněno na obr. 4a, WT FtsB a WT FtsQ spolu interagovaly. Podobně jako u testu BLI se FtsB (E68A) může vázat na WT FtsQ, zatímco vazebná afinita byla snížena přibližně dvojnásobně ve srovnání s WT FtsB. Mutované proteiny s výjimkou FtsB (E68A) snížily jejich schopnost interagovat s WT FtsQ. Je v souladu s výsledky vazby in vitro, což naznačuje, že mezifázové zbytky FtsQ (Y248) a FtsB (E69, R72 a E82) hrají důležitou roli při tvorbě komplexu FtsQB.

obrázek 4

molekulární interakce komplexu FtsQB in vivo. A) vliv mutací na mezifázové rezidua FtsQ a FtsB. Uvedené páry plazmidů byly zavedeny do reportérového kmene E. coli BTH101. Interakce FtsB a FtsQ byly hodnoceny bakteriálním dvouhybridním systémem. Vazebné aktivity byly měřeny β-galaktosidázovým testem a prezentovány jako Millerova jednotka. Ф, páteřní plazmid; B, ftsB; Q, ftsQ; * p < 0,05, * * p < 0,005 ve srovnání se skupinou exprimující T18 fúzovaný WT FtsB a T25 fúzovaný ftsq protein. (B) srovnání stability mezi WT A mutovanými proteiny. E. coli MG1655 nesoucí plasmid pUHE21-2-lacIq kódující C-terminál his značený WT nebo mutovaný protein byl odebrán v uvedených časových bodech po přidání chloramfenikolu a podroben Western blotting. DnaK byl použit jako Kontrola zatížení. C) in vivo účinek bodových mutací na FtsQ a FtsB. Funkce WT a mutovaných proteinů byla hodnocena peptidově konjugovanou PNA (PPNA). Kmeny E. coli MG1655, které obsahují indikované plazmidy, byly léčeny PPNA, komplementárními sekvencemi v chromozomu E.coli, ale ne v indikovaných plazmidech. Cfu byly měřeny po 3 h léčbě PNA. Významné rozdíly CFU jsou indikovány ve srovnání s kontrolní skupinou exprimující WT ftsB nebo ftsQ. *p < 0,05, * * p < 0,005, N. S. není významný ve srovnání s ftsB; # p < 0,05 ve srovnání s ftsQ; N. T. není léčen.

interakce mezi FtsQ a FtsB je nutná pro nábor navazujících FTS proteinů. Když je ftsq nebo FtsB vyčerpán nebo zaveden se škodlivou mutací, vede to k filamentaci a nakonec ke smrti buněk. Abychom vyhodnotili funkci interfaciálních zbytků FtsQB in vivo, provedli jsme test životaschopnosti buněk exprimujících WT nebo mutovaných proteinů peptidovými nukleovými kyselinami (PNAs). Předchozí studie ukázala, že peptidové konjugované PNAs (Ppna) zaměřené na esenciální geny měly baktericidní účinky na buňky E. coli32, 33, 34. Je známo, že vazebné místo ribozomu je klíčovým cílovým místem PNA pro inhibici translace32. Protože těsná vazba PNA na mRNA narušuje funkci ribozomu, brání se translaci proteinu33. Na základě těchto principů jsme navrhli čtyři antisense Ppna, které jsou komplementární k místům zahájení translace ftsB a ftsQ (Doplňkový obr. S4). Růst kmene E. coli MG1655 byl měřen za účelem zkoumání inhibičních účinků antisense PPNA1, PPNA2, PPNA3 a PPNA4. ftsb-cílení PPNA1 a FTSQ-cílení PPNA3 silně inhibovalo bakteriální růst a filamentaci E. coli (doplňkové obr. S4 a S5). Proto jsme využili PPNA1 a PPNA3 pro další experimenty. Konstruovali jsme indukované plazmidy exprimující mutanty WT FtsB, WT FtsQ, ftsb (E68A, E69R, R72E a E82R) a mutanty FtsQ (Y248A). Protože použité Ppna nemají žádné komplementární sekvence k rekombinantním plazmidům, neinterferují s proteinovou expresí v plazmidech. Kmeny exprimující WT nebo mutované proteiny nevykazovaly žádné významné rozdíly v jednotkách tvořících kolonie (CFU) po 3 hodinách bez PPNA. Buňky exprimující proteiny WT (FtsB nebo FtsQ) v plazmidu obnovily bakteriální růst při léčbě PPNA, ale buňka exprimující mutovaný protein neobnovila růst kromě FtsB (E68A) (obr. 4C). Také byla pozorována filamentace u bakterií exprimujících mutované proteiny postrádající schopnost obnovit růst při léčbě PPNA (Doplňkový obr. S5). Abychom vyloučili možnost, že by stabilita proteinu mohla ovlivnit funkci mutovaného proteinu, stanovili jsme také stabilitu proteinu in vivo blokováním de novo syntézy proteinů. Plazmid kódující FtsB nebo FtsQ fúzovaný s jeho značkou na C-konci byl zaveden do E. coli MG1655 a stabilita mutovaného proteinu byla porovnána s WT FtsB nebo FtsQ (obr. 4B a doplňkový obr. S6). Výsledkem bylo, že mutované proteiny s výjimkou FtsB (E68A) vykazovaly podobné výsledky jako WT. Ačkoli FtsB (E68A) byl nestabilní ve srovnání s WT FtsB, tento mutovaný protein FtsB (E68A) může doplňovat funkci WT FtsB a interagovat s FtsQ. Dohromady to naznačuje, že mutace mezifázových konzervovaných reziduí FtsQ (Y248) a FtsB (E69, R72 a E82) neovlivňují stabilitu proteinu, ale ruší interakci mezi FtsB a FtsQ.

oligomerní stavy FtsQB a FtsQBL v roztoku

dříve byly hlášeny protichůdné výsledky pro oligomerní stav proteinu FtsQ. Dimerizace FtsQ přes jeho transmembránovou oblast (nebo zbytky c-terminálu 30) byla pozorována v bakteriálním dvouhybridním experimentu18,35. Naproti tomu byl proveden přímý experiment pro stanovení Oligomerního stavu FtsQ v roztoku za použití analytické ultracentrifugace, což naznačuje, že FtsQ je monomer19. Nemůžeme však vyloučit možnost, že transmembránová oblast FtsQ ovlivňuje stav Oligomerizace FtsQ, protože analytický ultracentrifugační experiment byl proveden za použití periplazmatické oblasti FtsQ19. I když jsme také použili periplazmatické oblasti FtsQ, FtsQB a FtsQBL, předpokládali jsme, že jejich oligomerní stavy v roztoku závisí na koncentraci a že při vysokých koncentracích může dojít k další oligomeraci. Pro analýzu koncentračně závislých oligomerních stavů FtsQ, FtsQB nebo FtsQBL v roztoku byla provedena analytická gelová filtrace pomocí kolony Superdex 200 (10/300 GL) a experimentální poloměry Stokes (RH) byly porovnány s těmi, které byly vypočteny ze strukturních modelů (Doplňkový obr. S7). Strukturní modely FtsQ, FtsQB, a FtsQBL pro výpočet hodnot RH byly generovány na základě naší krystalové struktury ftsqb a SAXS struktury FtsQBL, jak je popsáno níže. Neviditelné segmenty N-A C-termini FtsQ, FtsB a FtsL byly modelovány jako flexibilní smyčky (Doplňkový obr. S7).

pro vysoké a nízké koncentrace FtsQ50–276 (370 a 18,5 µM) byl zdánlivý RH (3,03 a 2,83 nm) blíže teoretickému RH monomeru FtsQ50-276 (2,90 nm), což naznačuje, že FtsQ existuje hlavně jako monomer v roztoku (obr. 5). Naproti tomu u komplexu FtsQB byl zdánlivý RH (4, 33 nm) blíže k Rh (4, 87 nm) heterotetrameru 2:2 FtsQB (4, 87 nm) při vysokých koncentracích (138 µM), zatímco zdánlivý RH (3, 12 nm) byl blíže k RH (1:1 ftsqb heterodimer (3, 49 nm) při nízkých koncentracích (8 µM; obr. 5). Pro další podporu heterotetramerového modelu 2: 2 FtsQB byla molekulová hmotnost FtsQB při vysokých koncentracích (138 µM) měřena chromatografií s vyloučením velikosti s víceúhlovým rozptylem světla (SEC-MALS). Molekulová hmotnost FtsQB byla ve skutečnosti v souladu s komplexem ftsq a FtsB 2:2 (obr. 1C). Tyto výsledky naznačují, že FtsB zprostředkovává dimerizaci FtsQB, protože FtsQ existuje jako monomer při vysokých a nízkých koncentracích. Pro komplex FtsQBL byly heterohexamerické a heterotrimerní formy eluovány odděleně při gelové filtraci během čištění a byly shromažďovány odděleně. Každá forma byla stabilní, jak ukazuje SEC-MALS (obr. 1C), a dále se používá pro analýzu analytické gelové filtrace. Při vysokých a nízkých koncentracích komplexu FtsQBL (6,8–20 µM a 101-200 µM) byly zjevné hodnoty Rh heterohexamerického FtsQBL blíže hodnotám 2: 2:2 model FtsQBL (5, 59 nm), zatímco hodnoty Rh heterotrimerního FtsQBL byly blíže hodnotám modelu ftsqbl 1:1:1 (4, 28 nm) (obr. 5). To naznačuje, že heterohexamerické i heterotrimerní formy FtsQBL existují ve stabilní formě bez ohledu na jeho koncentrace.

obrázek 5

Oligomerace závislá na koncentraci ftsq50-276/FtsB25-103. A) analytické gelové filtrační profily FtsQ50-276 (fialová), FtsQ50–276/FtsB25–103 (červená), ftsqbl heterotrimer (světle zelená) a ftsqbl heterohexamer (tmavě zelená) při vysokých (101-370 µM; plné čáry a levá osa y) a nízkých (6,8-20 µM; tečkované čáry a pravá osa y) koncentracích. B) shrnutí hydrodynamické analýzy na obr. 5A. hodnoty RH ze sloupce byly porovnány s hodnotami vypočtenými ze strukturních modelů (Doplňkový obr. S7) pomocí programu HYDROPRO.

strukturální organizace tetrameru ftsqb

dále jsme zkoumali strukturální organizaci heterotetrameru ftsqb v řešení. Když jsme hodnotili krystalové balení komplexu FtsQB, potenciální heterotetramer FtsQB byl generován krystalografickými operacemi symetrie a vykazoval podlouhlou strukturu s celkovými rozměry 30 × 40 × 150 Å, takže heterodimer ftsqb dimerizoval antiparalelně od hlavy k hlavě prostřednictvím n-terminálních α-domén podjednotek FtsQ (Doplňkový obr. S7C). I když jsme spekulovali, že FtsQB tvoří větší oligomer prostřednictvím FtsB na základě analytických údajů o gelové filtraci, nemohli jsme vyloučit možnost, že heterotetramer ftsqb v roztoku byl vytvořen stejným rozhraním pozorovaným v krystalovém kontaktu. Zkoumali jsme tedy, zda se krystalografické rozhraní podílí na tvorbě heterotetrameru FtsQB. Na dimerovém rozhraní FtsQ tvoří přísně konzervované zbytky Leu57 a Phe87 na rozhraní hydrofobní jádro (Doplňkový obr. S 2 a); proto jsme předpokládali, že mutant FtsQB L57R nebo f87a existuje jako heterodimer bez ohledu na jeho koncentraci, pokud jsou Leu57 a Phe87 rozhodujícími zbytky pro sestavení heterotetrameru FtsQB. Mutanty L57R i F87A se však shromáždily do heterotetrameru 2: 2 pouze při vysokých koncentracích (Doplňkový obr. S8), což naznačuje, že pozorovaný heterotetramer FtsQB v roztoku nebyl vytvořen prostřednictvím n-terminálních α-domén podjednotek FtsQ.

dále jsme předpokládali, že vinutá cívková oblast FtsB je zodpovědná za dimerizaci heterodimerů ftsqb. V tomto případě jsme předpověděli, že mutant ftsqb lámající šroubovice l46p inhibuje dimerizaci heterodimerů ftsqb. Některé části mutantu FtsQB L46P se skutečně shromažďují do heterodimerů 1: 1, a to i při vysokých koncentracích (Doplňkový obr. S8). Tyto výsledky naznačují, že vinutá cívková oblast FtsB je rozhodující pro sestavení heterotetrameru ftsqb v roztoku. V 2:2 ftsqb heterotetramerový model, N-koncové směry obou podjednotek FtsB jsou orientovány ve stejném směru, a tak transmembránová oblast FtsB může také dimerizovat, aby se usnadnila homodimerace ftsb v plné délce. To může vysvětlit, proč byla oligomerace ftsqb vyššího řádu pozorována pouze při vysokých koncentracích. V souladu s našimi zjištěními, předchozí studie uváděla, že FtsB se sdružuje prostřednictvím periplazmatických vinutých cívek a transmembránových oblastí26. Pro vysoké a nízké koncentrace e5-FtsB25-103 / k5-FtsL64-121 (191, respektive 22,2 µM) je zdánlivá RH (obě 4.50 nm) byl blíže teoretickému RH heterotetrameru 2:2 E5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (4,38 nm), což naznačuje, že e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 existuje hlavně jako heterotetramer v roztoku (Doplňkový obr. S8). V souladu s tím nedávná studie využívající analýzu pražců a výpočetní metody také ukázala, že komplex FtsBL tvoří tetramer36.

SAXS struktura komplexu FtsQBL

pro stanovení celkové konformace komplexu FtsQBL v roztoku byly shromážděny údaje SAXS. 1: 1: 1 nebo 2: 2:2 komplex FtsQBL byl použit ke stanovení ab initio struktury molekulární obálky při nízkých a vysokých koncentracích (obr. 6A a doplňkový obr. S9). Zajímavé je, že celková obálka komplexu FtsQBL 2: 2: 2 vykazovala podlouhlý tvar“ Y “ (obr. 6A). I když obálka nevykazovala dostatečné podrobnosti pro umístění jednotlivých domén FtsQ, FtsB a FtsL, Pozorovali jsme, že velká obálka s konkávním povrchem přiměřeně dobře odpovídá tvaru FtsQ (obr. 6A). Pro začlenění dvou molekul FtsQ do velké obálky s konkávním povrchem by měly být N-koncové směry FtsQ a FtsBL opačné. To bylo neočekávané, protože předchozí modely tvořené jinými skupinami měly N-terminální transmembránové šroubovice orientované ve stejném směru20. Krystalová struktura komplexu FtsQ50-276/FtsB25-103 byla úspěšně začleněna do molekulární obálky (obr. 6A a doplňkový obr. S9), což naznačuje, že celková konformace komplexu FtsQ50-276-FtsB25-103 je v roztoku poměrně tuhá. Přídavná obálka byla přiřazena polohám heterotetramerové stočené cívky a ftsbl E5-a K5-cívek (obr. 6A). Nedávno bylo navrženo, že subkomplex FtsBL je heterotetramer 2: 2 s nepřerušovanou spirálou FtsL spojující transmembránovou a periplazmatickou vinutou cívku36; proto může FtsQBL ve tvaru Y dobře zapadat do zakřivené membrány pro membránové ukotvení (obr. 6B). Vzhledem k nízkému rozlišení obálky SAXS bylo obtížné jasně definovat konstrukční sestavu FtsQBL; proto je nutné další strukturální stanovení. I když jsme pozorovali 2:2 ftsqb heterotetramer a 2:2:2 ftsqbl heterohexamer tvorba in vitro, zda tyto formy existují in vivo, zůstává nejasná a další studie jsou nutné k odhalení fyziologické stechiometrie dělitele. Je však třeba poznamenat, že FtsQBL byl dříve navržen k vytvoření komplexu 2: 2: 2 v divizi37. Přestože jsou potřebné další studie, aby bylo možné plně porozumět strukturální organizaci FtsQBL v divisome assembly, naše data poskytují základ pro další vyšetřování.

obrázek 6

struktura řešení SAXS FtsQBL a celkový model komplexu FtsQBL. (A) SAXS řešení struktury FtsQBL 1: 1: 1 trimer a 2:2: 2 hexamer. Strukturální modely komplexů FtsQBL (1: 1: 1 a 2: 2: 2) byly rekonstruovány pomocí programu ab initio shape determination dammif. Pro každý protein bylo vygenerováno 10 nezávislých modelů, porovnáno a průměrný model byl vypočítán pomocí programu DAMAVER. Povrchové Vykreslování konstrukčních modelů bylo dosaženo pomocí programu PyMOL. Pro porovnání celkových tvarů a rozměrů, pásový diagram atomových modelů proteinů FtsQBL byly superponovány na rekonstruované modely fiktivních atomů pomocí programu SUPCOMB. NSD = 7.039 pro model 1:1:1 a 3.800 pro model 2:2:2. B) celkový model FtsQBL ve tvaru Y. Je ukázáno sdružení FtsQBL náborem komplexu FtsBL do FtsQ. Každý řetězec je zastoupen v jiné barvě.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.