Conocimientos Estructurales del Complejo FtsQ/FtsB/FtsL, un Componente Clave del Divisor

Interacciones intermoleculares de FtsQ y FtsB

Estudios previos mostraron que el subcomplejo periplásmico de FtsB y FtsL se puede reconstituir reemplazando las regiones de membrana de ambas proteínas con bobinas en espiral solubles con carga opuesta (e5 y k5 en la Fig. 1A) 20,21,22. Utilizando esta técnica, se reconstituyó un complejo binario estable (FtsBL) consistente en FtsB y FtsL mediante la coexpresión de e5-FtsB25-103 y k5–FtsL64-121 en células de E. coli (Fig. 1A y Suplemento Fig. S2). El complejo ternario (FtsQBL) compuesto por FtsQ, e5-FtsB y k5-FtsL se reconstituyó mezclando un pellet de células húmedas que contenía FtsQ50–276 sobreexpresado y un pellet de células que contenía e5-FtsB25–103 sobreexpresado y k5-FtsL64–121. Los complejos FtsBL y FtsQBL se co-eluyeron a partir de una columna de afinidad y se co-migraron en columnas de exclusión de tamaño (Fig. 1B, C). Se formó el complejo estable FtsQ50–276-FtsB25–103 (Fig. 1B), pero FtsQ no tenía afinidad de unión con k5-FtsL64–121 en ausencia de e5-FtsB25–103 (datos no mostrados), consistente con un estudio anterior20. Para mapear con precisión la región de unión entre FtsQ y FtsB, se diseñaron dos construcciones (FtsB25–60 y FtsB61–103) con regiones truncadas N o C terminales de FtsB25 – 103 y se examinaron sus interacciones con FtsQ50-276 en un experimento de interferometría de bio–capa (BLI) (Fig. 1D). FtsQ50-276 unido al complejo FtsB25-103 con una constante de disociación (KD) de 0,67 µM (Fig. 1D). Entre los dos constructos FtsB (FtsB25–60 y FtsB61–103), solo la unión de FtsB61–103 a FtsQ50–276 fue estable (KD = 0,9 µM), lo que sugiere que la región C-terminal de FtsB (principalmente residuos 61-103) contribuye principalmente a la unión de FtsQ (Fig. 1D), consistente con un resultado previo de que el terminal C de FtsB es necesario para la interacción con FtsQ25. Aunque otro estudio previo sugirió que una región proximal de membrana de FtsQ es otro punto de interacción para la unión de ftsb23, en nuestro experimento no se observó unión estable de FtsQ50–276 con FtsB25–60 (Fig. 1D).

Gráfico 1

Asignación de la región de enlace FtsQ-FtsB-FtsL. (A) Arquitectura de dominio de FtsQ, FtsB y FtsL. Las construcciones se indican mediante líneas grises y se muestra la reconstitución de FtsB y FtsL utilizando bobinas e5 y k5. B) PÁGINA SDS de los complejos FtsQ50–276, FtsQ50–276/FtsB25–103 y FtsQ50–276/e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (FtsQBL). Los geles DE PÁGINA SDS se visualizaron con azul de Coomassie. C) Heterohexámero FtsQBL (3 mg/ml, línea verde claro), heterotrímero FtsQBL (3 mg/ml, línea roja), FtsQB (10 mg/ml, línea azul) y FtsQ (10 mg/ml, línea negra) fueron analizados por SEC-MALS. La línea gruesa representa la masa molecular medida. D) Ensayos representativos de BLI de FtsQ50 – 276 con FtsB25–103, FtsB61–103 y FtsB25–60. Los sensores BLI con diferentes concentraciones de analitos se indican con diferentes colores. El análisis de equilibrio y el KD calculado se muestran para cada construcción en los paneles de la derecha. Los experimentos se repitieron tres veces.

Estructura cristalina del complejo FtsQ-FtsB

Para obtener más información sobre la organización estructural del complejo FtsQB, determinamos la estructura de resolución de 2,9 Å del FtsQ50-276 unido al FtsB25-103 (Fig. 2, Suplemento Fig. S3 y cuadro 1). El mapa de densidad electrónica de los residuos 25-60 no se observó para el FtsB25–103, mientras que se encontró que casi todas las secuencias del FtsQ50–276 estaban ordenadas con la excepción de las regiones flexibles terminales N y C (residuos 50-52 y 262-276, respectivamente; Fig. 2A y Suplemento Fig. S3). Consistentemente, no se observó el mapa de densidad electrónica de FtsB N-terminal (residuos 22-63) para FtsB en la estructura cristalina del complejo FtsQB, lo que fue reportado recientemente por otro grupo26. Una posibilidad con respecto a la falta de densidad electrónica es que la hélice proximal de membrana esté desordenada en el cristal del complejo FtsQB; sin embargo, la estructura cristalina de los 30 aminoácidos de membrana juxta del FtsB mostró que forma una bobina canónica enroscada27, por lo que excluimos esta posibilidad. Otra posibilidad es que la hélice proximal de membrana se escinda automáticamente durante la purificación y cristalización, de modo que la construcción restante (FtsQ50–276-FtsB61–103) se cristaliza fácilmente. Dado que las simulaciones de dinámica molecular anteriores del complejo FtsQBL mostraron que la parte central de FtsB alrededor del residuo Leu60 se presenta con una ruptura helicoidal28, predijimos que la parte central de FtsB alrededor de Leu60 es propensa a la proteólisis.

Gráfico 2

Estructura general del complejo FtsQ50–276/FtsB25–103. A) Diagramas de cinta estéreo del complejo FtsQB. El mapa de densidad electrónica de residuos 61-95 solo se observó para FtsB25-103. Cada cadena se muestra en un color diferente. (B,C) Vista estéreo ampliada que muestra los detalles de la interacción en la interfaz de FtsQ y FtsB. Cada cadena se muestra en un color diferente.

Cuadro 1 Estadísticas de recopilación y perfeccionamiento de datos.

La estructura general de FtsQ50 – 276 consta de dos dominios, α y β, y el dominio β es responsable de la unión de FtsB25-103 (Fig. 2A). La superficie accesible a disolventes enterrada en la interfaz entre FtsQ y FtsB era de 1330 Å2, aproximadamente el 20% de la superficie monomérica de FtsQ. Además, aproximadamente el 50% de los átomos no hidrogenados en la interfaz entre FtsQ y FtsB son polares, como lo indican los cálculos de área de superficie de isovelocidad proximal29. La secuencia FtsB (residuos 61-95) se pliega en una hélice α (α3) y una hebra β (β1; Fig. 2A). El motivo de la hebra α-hélice-vuelta-β comienza con la hélice α (residuos 64-75), seguida de un bucle torcido (residuos 76-82), un hilo β corto (residuos 83-85) y otro bucle terminal torcido (residuos 86-95; Fig. 2C); los dos bucles retorcidos contienen dos residuos de prolina (Pro80 y Pro89; Fig. 2C). Curiosamente, la hélice FTSQ α5 adopta una forma retorcida al incorporar Pro228 en el centro y esta forma parece ser crucial para sus extensos contactos con FtsB. Cuando Tyr precede a Pro en la secuencia de aminoácidos, aumenta la tendencia del residuo Pro a adquirir una conformación cis30; sin embargo, el residuo Pro228 de FtsQ adopta una conformación trans (Fig. 2C).

Modos de unión de FtsQ en complejo con FtsB

Aunque el análisis espectrométrico de masas previo por fotoenlaces indicó que las regiones C-terminales de FtsQ y FtsB son puntos calientes de interacción cruciales, las interacciones detalladas propuestas por el análisis espectrométrico de masas fueron completamente diferentes de las observadas en nuestra estructura cristalina (Fig. 2). Sobre la base del análisis espectrométrico de masas, se sugirió que el C-terminal de FtsB alrededor del residuo Met77 forma una interacción tipo hoja β con la hebra C-terminal de FtsQ alrededor del residuo Gly25523. En contraste con estos datos, nuestra estructura cristalina mostró que la región alrededor del residuo Met77 de FtsB no formaba una estructura secundaria, y la dirección de su cadena lateral es opuesta a la región de unión esperada de FtsQ (Fig. 2C). En nuestra estructura cristalina, la región C-terminal de FtsB (residuos 61-103) interactúa ampliamente con el dominio β de FtsQ y contribuye principalmente a la unión de FtsQ. El bucle retorcido entre la hélice α (residuos 64-75) y la hebra β (residuos 83-85) envuelve el residuo Tyr248 de FtsQ (Fig. 2B). Para estabilizar la conformación de bucle torcido, cuatro residuos FtsB (Glu68, Arg72, Arg79 y Glu82) forman un grupo con extensas redes de puentes salinos (Fig. 3A). FtsB Glu68 forma puentes salinos con Arg72 (2,8 Å) y Arg79 (2,8 Å), mientras que Arg72 forma un puente salino con Glu82 (2,8 Å y 3).0 Å, respectivamente; Fig. 3A); el átomo Arg72 NH2 forma una interacción adicional con el átomo Glu68 OE2 (2,8 Å; Fig. 3A). El cúmulo de puente salino de FtsB es crucial en la formación de enlaces de hidrógeno (2,7 Å) entre el átomo de oxígeno de FtsQ Tyr248 y el átomo NH1 de FtsB Arg72 (Fig. 3A). Además, FtsB Glu69 forma un puente salino con FtsQ Arg196(2,3 Å; Fig. 3A). Curiosamente, la hebra β de FtsB forma una lámina β continua con la de FtsQ mediante apilamiento antiparaleal con β12 (Fig. 2C). FtsB Phe84 forma contactos cercanos con FtsQ Tyr248, mientras que Tyr85 reside muy cerca del núcleo hidrofóbico del dominio β FtsQ que consiste en Leu226, Leu230, Val254 y Trp256 (Fig. 2B). FtsB Leu87 también forma amplios contactos con FtsQ Leu226 y la porción alifática de Arg222 (Fig. 2C).

Gráfico 3

Interacciones moleculares del complejo FtsQB en detalle. A) Vistas ampliadas que muestran interacciones detalladas en las interfaces FtsQ y FtsB. Se muestran diagramas de cinta de FtsB y diagramas de superficie de FtsQ. Las superficies rojas indican residuos 100% conservados de FtsQ (Fig. S2). (B) Ensayos representativos de BLI del complejo FTSQ-FtsBL WT y mutantes (FtsQ Y248A, FtsB E68A, FtsB E69R, FtsB R72E y FtsB E82R). Los sensores BLI con diferentes concentraciones de analitos se indican con diferentes colores. El análisis de equilibrio y el KD calculado se muestran para cada construcción en los paneles de la derecha.

Para evaluar las contribuciones de los residuos interfaciales del complejo FtsQB, los residuos conservados interfaciales de FtsQ (Tyr248) y FtsB (Glu68, Glu69, Arg72 y Glu82) fueron mutados y sus interacciones fueron examinadas por BLI. Las afinidades de unión entre FtsQ y FtsB se midieron mediante inmovilización de tipo salvaje (WT) o mutantes de GST-e5-FtsB en complejo con k5-FtsL. Como era de esperar, la mutación de los residuos interfaciales produjo grandes reducciones de afinidad en comparación con el peso (KD = 0,24 µM). El valor KD del mutante Y248A no se pudo medir debido a la unión débil, mientras que E68A redujo la afinidad en aproximadamente 10 veces (Fig. 3B). Las mutaciones de reversión de carga E69R, R72E y E82R de FtsB casi abolieron la unión a FtsQ (Fig. 3B). Esto destaca el papel de FtsQ Tyr248 y el motivo FtsB α-hélice-giro-β-filamento como determinantes de afinidad.

Interfaz FtsQ y FtsB in vivo

Para verificar la unión in vitro de las regiones periplásmicas de FtsB y FtsQ, realizamos un ensayo bacteriano de dos híbridos basado en una cascada de señalización de AMP cíclico31. Como el N-terminal de la proteína Fts fusionada con T18 o T25 era tóxico para E. coli y tiene un cierto grado de problema de inestabilidad, construimos proteínas Fts fusionadas con C-terminal (T25-FtsQ, T18-FtsB)18. La cepa reportera de E. coli BTH101 se co-transformó con un par de plásmidos indicados y la eficiencia de unión se determinó mediante el ensayo de β-galactosidasa (Fig. 4A). Como se muestra en la Fig. 4A, WT FtsB y WT FtsQ interactuaron entre sí. De forma similar al ensayo BLI, FtsB (E68A) puede unirse a WT FtsQ, mientras que la afinidad de unión se redujo aproximadamente dos veces en comparación con WT FtsB. Las proteínas mutadas, excepto el FtsB (E68A), disminuyeron su capacidad de interactuar con el WT FtsQ. Es consistente con los resultados de unión in vitro, lo que indica que los residuos interfaciales de FtsQ (Y248) y FtsB (E69, R72 y E82) desempeñan un papel importante en la formación del complejo FtsQB.

Gráfico 4

Interacciones moleculares del complejo FtsQB in vivo. A) El efecto de las mutaciones en los residuos interfaciales de FtsQ y FtsB. Los pares de plásmidos indicados se introdujeron en una cepa reportera E. coli BTH101. Las interacciones de FtsB y FtsQ fueron evaluadas por el sistema bacteriano de dos híbridos. Las actividades de unión se midieron mediante el ensayo de β-galactosidasa y se presentaron como unidad Miller. Ф, plásmido troncal; B, ftsB; Q, ftsQ; *p < 0,05, **p < 0,005 en comparación con el grupo que expresa la proteína FtsB con peso fusionado T18 y la proteína FtsQ fusionada T25. B) Comparación de la estabilidad entre el peso y las proteínas mutadas. E. coli MG1655 que contiene plásmido pUHE21-2-lacIq que codifica proteína en peso marcada con His C-terminal o proteína mutada se muestreó en los puntos de tiempo indicados después de agregar cloranfenicol y se sometió al Western bloting. DnaK se utilizó como control de carga. C) El efecto in vivo de mutaciones puntuales en FtsQ y FtsB. La función del peso y de las proteínas mutadas se evaluó mediante la ANP conjugada con péptidos (ANPP). Las cepas de E. coli MG1655 que albergaban los plásmidos indicados se trataron con PPNA, secuencias complementarias en el cromosoma de E. coli, pero no en los plásmidos indicados. Las UFC se midieron después del tratamiento con ANP de 3 h. Se indican diferencias significativas de UFC en comparación con el grupo de control que expresa WT ftsB o ftsQ. * p < 0,05, * * p < 0,005, N. S. no significativa en comparación con ftsB; # p < 0,05 en comparación con ftsQ; N. T. no tratada.

La interacción entre FtsQ y FtsB es necesaria para reclutar proteínas Fts aguas abajo. Cuando el FtsQ o el FtsB se agotan o se introducen con mutaciones perjudiciales, conduce a la filamentación y, finalmente, a la muerte de las células. Para evaluar la función in vivo de los residuos interfaciales FtsQB, se realizó un ensayo de viabilidad de células que expresaban proteínas WT o mutadas con ácidos nucleicos peptídicos (PNAs). Un estudio previo demostró que los PNAs conjugados con péptidos (PPNAs) dirigidos a genes esenciales tenían efectos bactericidas en las células de E. coli32,33,34. Se sabe que el sitio de unión del ribosoma es un sitio diana clave de la ANP para inhibir la traducción32. Como la unión estrecha de la ANP al ARNm interfiere con la función del ribosoma, se evita la traducción de proteínas33. Sobre la base de estos principios, diseñamos cuatro PPNA antisentidos que son complementarios a los sitios de iniciación de traducción de ftsB y ftsQ (Suplemento Fig. S4). Se midió el crecimiento de la cepa E. coli MG1655 para examinar los efectos inhibitorios de los PPNA1, PPNA2, PPNA3 y PPNA4 antisentidos. Se observó un crecimiento bacteriano y filamentación de E. coli fuertemente inhibidos por el ftsB-PPNA1 y el ftsQ-PPNA3 (Higos suplementarios S4 y S5). Por lo tanto, utilizamos PPNA1 y PPNA3 para otros experimentos. Construimos plásmidos inducibles que expresaban WT FtsB, WT FtsQ, mutantes FtsB (E68A, E69R, R72E y E82R) y mutantes FtsQ (Y248A). Como los ARNP utilizados no tienen secuencias complementarias a los plásmidos recombinantes, no interfieren con la expresión de proteínas en plásmidos. Las cepas que expresaban WT o proteínas mutadas no mostraron diferencias significativas en las unidades formadoras de colonias (UFC) a las 3 h sin PPNA. Las células que expresan las proteínas WT (FtsB o FtsQ) en el plásmido recuperaron el crecimiento bacteriano cuando se trataron con PPNA, pero la célula que expresa la proteína mutada no recuperó el crecimiento excepto para el FtsB (E68A) (Fig. 4C). Además, se observó filamentación en bacterias que expresaban proteínas mutadas que carecían de la capacidad de recuperar el crecimiento cuando se trataban con ADNP (Suplemento Fig. S5). Para excluir la posibilidad de que la estabilidad proteica pudiera afectar la función de la proteína mutada, también determinamos la estabilidad proteica in vivo bloqueando la síntesis proteica de novo. El plásmido codificador FtsB o FtsQ fusionado con su etiqueta en el terminal C se introdujo en E. coli MG1655, y la estabilidad de la proteína mutada se comparó con la FtsB o FtsQ en peso (Fig. 4B y Suplemento Fig. S6). Como resultado, las proteínas mutadas a excepción de FtsB (E68A) mostraron resultados similares a los de WT. Aunque FtsB (E68A) fue inestable en comparación con FtsB en peso, esta proteína mutada FtsB (E68A) puede complementar la función de FtsB en PESO e interactuar con FtsQ. En conjunto, sugiere que las mutaciones de los residuos conservados interfaciales de FtsQ (Y248) y FtsB (E69, R72 y E82) no afectan la estabilidad de la proteína, sino que suprimen la interacción entre FtsB y FtsQ.

Estados oligoméricos de FtsQB y FtsQBL en solución

Anteriormente, se reportaron resultados contradictorios para el estado oligomérico de la proteína FtsQ. Se observó dimerización de FtsQ a través de su región transmembrana (o residuos C-terminal 30) en un experimento bacteriano de dos hibridos18,35. Por el contrario, se realizó un experimento directo para determinar el estado oligomérico de FtsQ en solución mediante ultracentrifugación analítica, indicando que FtsQ es un monómero19. Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que la región transmembrana de FtsQ afecte el estado de oligomerización de FtsQ, ya que el experimento analítico de ultracentrifugación se realizó utilizando la región periplásmica de FtsQ19. A pesar de que también utilizamos las regiones periplásmicas de FtsQ, FtsQB y FtsQBL, planteamos la hipótesis de que sus estados oligoméricos en solución dependen de la concentración y que puede ocurrir una oligomerización adicional en concentraciones altas. Para analizar los estados oligoméricos dependientes de la concentración de FtsQ, FtsQB o FtsQBL en solución, se realizó una filtración analítica de gel utilizando una columna Superdex 200 (10/300 GL) y se compararon los radios de Stokes experimentales (RH) con los calculados a partir de modelos de estructura (Fig.Suplementaria). S7). Se generaron modelos de estructura de FtsQ, FtsQB y FtsQBL para calcular los valores de HR basados en nuestra estructura cristalina de FtsQB y la estructura SAXS de FtsQBL como se describe a continuación. Los segmentos invisibles de los terminales N y C de FtsQ, FtsB y FtsL se modelaron como bucles flexibles (Suplemento Fig. S7).

Para concentraciones altas y bajas de FtsQ50–276 (370 y 18,5 µM, respectivamente), el RH aparente (3,03 y 2,83 nm, respectivamente) estaba más cerca del RH teórico del monómero FtsQ50–276 (2,90 nm), lo que sugiere que el FtsQ existe principalmente como monómero en solución (Fig. 5). En contraste, para el complejo FtsQB, la HR aparente (4,33 nm) estaba más cerca de la del heterotetrámero FtsQB 2:2 (4,87 nm) a altas concentraciones (138 µM), mientras que la HR aparente (3,12 nm) estaba más cerca de la del heterodímero FtsQB 1:1 (3,49 nm) a bajas concentraciones (8 µM; Fig. 5). Para apoyar aún más el modelo de heterotetrámero FtsQB 2:2, se midió el peso molecular del FtsQB a altas concentraciones (138 µM) mediante cromatografía de exclusión de tamaño con dispersión de luz de múltiples ángulos (SEC-MALS). De hecho, la masa molecular de FtsQB fue consistente con un complejo 2: 2 de FtsQ y FtsB (Fig. 1C). Estos resultados sugieren que el FtsB media la dimerización del FtsQB, ya que el FtsQ existe como monómero en concentraciones altas y bajas. Para el complejo FtsQBL, las formas heterohexaméricas y heterotriméricas se eluyeron por separado en la filtración de gel durante la purificación y se recolectaron por separado. Cada forma era estable según lo indicado por SEC-MALS (Fig. 1C), y se utiliza además para el análisis de filtración analítica de gel. A concentraciones altas y bajas del complejo FtsQBL (6,8–20 µM y 101-200 µM, respectivamente), los valores de HR aparentes de FTSQBL heterohexamérico fueron más cercanos a los del 2: 2:2 modelo FtsQBL (5,59 nm), mientras que los valores de HR del modelo FTSQBL heterotrimérico fueron más cercanos a los del modelo FtsQBL 1:1:1 (4,28 nm) (Fig. 5). Esto sugiere que tanto las formas heterohexaméricas como heterotriméricas de FtsQBL existen en una forma estable independientemente de sus concentraciones.

Gráfico 5

Oligomerización dependiente de la concentración de FtsQ50-276 / FtsB25-103. A) Perfiles analíticos de filtración en gel de FtsQ50–276 (púrpura), FtsQ50–276/FtsB25-103 (rojo), heterotrímero FtsQBL (verde claro) y heterohexámero FtsQBL (verde oscuro) a concentraciones altas (101-370 µM; líneas sólidas y eje y izquierdo) y bajas (6,8–20 µM; líneas punteadas y eje y derecho). B) Resumen del análisis hidrodinámico en la Fig. 5A. Los valores de HR de la columna se compararon con los calculados a partir de modelos de estructura (Fig. S7) utilizando el programa HYDROPRO.

Organización estructural del tetrámero FtsQB

A continuación examinamos la organización estructural del heterotetrámero FtsQB en solución. Cuando evaluamos el empaquetamiento cristalino del complejo FtsQB, se generó un heterotetrámero FtsQB potencial a través de operaciones de simetría cristalográfica y exhibió una estructura alargada con dimensiones totales de 30 × 40 × 150 Å, de modo que el heterodímero FtsQB se dimerizó de forma antiparalela cabeza a cabeza a través de los dominios α N-terminales de las subunidades FtsQ (Fig.Suplementaria. S7C). Aunque especulamos que FtsQB forma un oligómero más grande a través de FtsB basado en datos analíticos de filtración de gel, no pudimos descartar la posibilidad de que el heterotetrámero FtsQB en solución se formara por la misma interfaz observada en el contacto cristalino. Por lo tanto, examinamos si la interfaz cristalográfica está involucrada en la formación del heterotetrámero FtsQB. En la interfaz de dímeros de FtsQ, los residuos Leu57 y Phe87 estrictamente conservados forman un núcleo hidrófobo en la interfaz (Fig. S2A); por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el mutante FtsQB L57R o F87A existe como heterodímero independientemente de su concentración si Leu57 y Phe87 son residuos cruciales para el ensamblaje del heterotetrámero FtsQB. Sin embargo, los mutantes L57R y F87A se ensamblaron en un heterotetrámero 2:2 solo a altas concentraciones (Fig. S8), sugiriendo que el heterotetrámero FtsQB observado en solución no se formó a través de los dominios α N-terminales de las subunidades FtsQ.

A continuación planteamos la hipótesis de que la región de bobina enrollada de FtsB es responsable de la dimerización de heterodímeros FtsQB. En este caso, predijimos que un mutante L46P que rompe hélices de FtsQB inhibe la dimerización de heterodímeros FtsQB. De hecho, algunas porciones del mutante FtsQB L46P se ensamblan en heterodímeros 1: 1, incluso a altas concentraciones (Fig. S8). Estos resultados sugieren que la región de la bobina enrollada del FtsB es crucial para el ensamblaje del heterotetrámero FtsQB en solución. En el 2:2 Modelo de heterotetrámero FtsQB, las direcciones N-terminales de ambas subunidades FtsB están orientadas en la misma dirección, y por lo tanto la región transmembrana de FtsB también puede dimerizarse para facilitar la homodimerización de FtsB de longitud completa. Esto puede explicar por qué se observó oligomerización de orden superior de FtsQB solo en concentraciones altas. De acuerdo con nuestros hallazgos, un estudio previo informó que el BTS se autoasociaba a través de la bobina en espiral periplásmica y las regiones transmembranas26. Para concentraciones altas y bajas de e5-FtsB25-103 / k5–FtsL64-121 (191 y 22,2 µM, respectivamente), el HR aparente (ambos 4.50 nm) estaba más cerca de la HR teórica del heterotetrámero 2: 2 de e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (4,38 nm), lo que sugiere que e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 existe principalmente como heterotetrámero en solución (Fig. S8). De acuerdo con esto, un estudio reciente que utiliza análisis de trastes y métodos computacionales también mostró que el complejo FtsBL forma un tetrámero36.

Estructura SAXS del complejo FtsQBL

Para determinar la conformación general del complejo FtsQBL en solución, se recolectaron datos SAXS. El 1:1:1 o 2:2:2 Se utilizó el complejo FtsQBL para determinar la estructura ab initio de la envoltura molecular a concentraciones bajas y altas, respectivamente (Fig. 6A y Suplemento Fig. S9). Curiosamente, la envolvente general del complejo FtsQBL 2:2:2 mostró una forma de «Y» alargada (Fig. 6A). A pesar de que la envoltura no mostraba suficientes detalles para posicionar los dominios individuales de FtsQ, FtsB y FtsL, observamos que la envoltura grande con una superficie cóncava se ajustaba razonablemente bien a la forma de FtsQ (Fig. 6A). Para incorporar las dos moléculas FtsQ en la envoltura grande con una superficie cóncava, las direcciones N-terminales de FtsQ y FtsBL deben ser opuestas. Esto fue inesperado, ya que los modelos anteriores formados por otros grupos poseían hélices transmembranas N-terminales orientadas en la misma dirección20. La estructura cristalina del complejo FtsQ50–276/FtsB25–103 se incorporó con éxito a la envoltura molecular (Fig. 6A y Suplemento Fig. S9), lo que indica que la conformación general del complejo FtsQ50–276-FtsB25–103 es bastante rígida en solución. La envolvente adicional se asignó a las posiciones de la bobina en espiral heterotetramérica y las bobinas FtsBL e5 y k5 (Fig. 6A). Recientemente se sugirió que el subcomplex FtsBL es un heterotetrámero 2: 2 con una hélice FtsL ininterrumpida que une la transmembrana y la bobina en espiral periplásmica36; por lo tanto, el FtsQBL en forma de Y puede caber bien en la membrana curva para el anclaje de la membrana (Fig. 6B). Debido a la baja resolución de la envolvente SAXS, fue difícil definir claramente el conjunto estructural de FtsQBL; por lo tanto, se requiere una determinación estructural adicional. Aunque observamos 2:La formación de heterotetrámeros 2 FtsQB y heterohexámeros 2:2:2 FtsQBL in vitro, si estas formas existen in vivo, no está clara y se requieren estudios adicionales para revelar la estequiometría fisiológica del divisor. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que FtsQBL fue sugerido previamente para formar un complejo 2:2:2 en la divisón37. Aunque se necesitan estudios adicionales para comprender completamente la organización estructural de FtsQBL en el ensamblaje de divisores, nuestros datos proporcionan una base para una investigación adicional.

Gráfico 6

Estructura de solución SAXS de FtsQBL y modelo general del complejo FtsQBL. A) Estructuras de solución SAXS de FTSQBL trimer 1: 1: 1 y hexámero 2: 2: 2. Los modelos estructurales de los complejos FtsQBL (1:1:1 y 2:2:2) se reconstruyeron utilizando el programa de determinación de formas ab initio DAMMIF. Para cada proteína, se generaron 10 modelos independientes, se compararon y se calculó un modelo promedio utilizando el programa DAMAVER. El renderizado superficial de los modelos estructurales se logró utilizando el programa PyMOL. Para comparar formas y dimensiones generales, el diagrama de cinta de los modelos atómicos de proteínas FtsQBL se superpuso a los modelos de átomos ficticios reconstruidos utilizando el programa SUPCOMB. NSD = 7,039 para el modelo 1:1:1 y 3,800 para el modelo 2:2:2. B) Modelo general de FtsQBL en forma de Y. Se muestra la asociación FtsQBL reclutando el complejo FtsBL para FtsQ. Cada cadena está representada en un color diferente.

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