Structural Insights into the Ftsq/FtsB/FtsL Complex, a Key Component of the Ftsq / Ftsb / FtsL Complex, a Key Component of the Divisome

Intermolecular interactions of Ftsq and Ftsb

aiemmat tutkimukset osoittivat, että FtsB: n ja FtsL: n periplasminen subkompleksi voidaan palauttaa korvaamalla molempien proteiinien kalvoalueet vastakkaisesti varatut liukoiset kelat (E5 ja K5 kuviossa. 1 A) 20,21,22. Tätä tekniikkaa käyttäen ftsb: stä ja FtsL: stä koostuva stabiili binäärikompleksi (ftsbl) palautettiin E. coli-soluissa koekspressoimalla E5-FtsB25–103 ja k5-FtsL64–121 (Kuva. 1A ja täydentävä Kuva. S2). Ftsq: sta, e5-FtsB: stä ja k5-FtsL: stä koostuva ternaarinen kompleksi (ftsqbl) saatettiin ennalleen sekoittamalla yli–ilmentynyttä ftsq50-276: ta sisältävää märkäsellettiä ja yli–ilmentynyttä e5-FtsB25–103: A ja k5-FtsL64-121: tä sisältävää solusellettiä. Ftsbl-ja FtsQBL-kompleksit yhdistettiin affiniteettikolonnista ja yhdistettiin koon poissulkevilla sarakkeilla (Fig. 1B, C). Stabiili FtsQ50–276-FtsB25-103 kompleksi muodostui (Kuva. 1B), mutta ftsq: lla ei ollut sitovaa affiniteettia k5-FtsL64–121: n kanssa e5-FtsB25–103: n puuttuessa (tietoja ei näy), mikä on yhdenmukaista aiemman tutkimuksen 20 kanssa. Ftsq: n ja FtsB: n välisen sitovan alueen tarkkaan kartoittamiseksi suunniteltiin kaksi konstruktiota (FtsB25–60 ja FtsB61–103), joissa oli ftsb25 – 103: n typistettyjä n-tai C–terminaalialueita, ja niiden vuorovaikutusta FtsQ50–276: n kanssa tutkittiin bio-layer interferometry (BLI) – kokeessa (Fig. 1D). FtsQ50–276 sitoutuneena ftsb25-103-kompleksiin, jonka dissosiaatiovakio (KD) on 0,67 µM (Kuva. 1D). Kahdesta FtsB-konstruktiosta (FtsB25–60 ja FtsB61–103) vain FtsB61–103 sitoutui ftsq50-276: een stabiilisti (KD = 0,9 µM), mikä viittaa siihen, että FtsB: n C-terminaalinen alue (pääasiassa jäämät 61-103) vaikuttaa pääasiassa FtsQ: n sitoutumiseen (Kuva. 1D), joka on yhdenmukainen aiemman tuloksen kanssa, jonka mukaan ftsb: n C-terminaali on välttämätön vuorovaikutuksessa FtsQ25: n kanssa. Vaikka toinen aiempi tutkimus ehdotti, että ftsq: n membraani-proksimaalinen alue on toinen ftsb binding23: n interaktiopesäke, ftsq50–276: n vakaata sitoutumista FtsB25–60: een ei havaittu kokeessamme (Kuva. 1D).

Kuva 1

Ftsq-FtsB-FtsL-Sidonta-alueen kartoitus. (A) Ftsq: n, FtsB: n ja FtsL: n toimialueen arkkitehtuuri. Konstruktiot on merkitty harmailla viivoilla ja ftsb: n ja FtsL: n ennallistaminen E5 – ja k5-keloilla on esitetty. (B) SDS–sivu ftsq50–276, FtsQ50–276/FtsB25-103 ja ftsq50–276/e5-FtsB25–103/k5-FtsL64-121 (ftsqbl) komplekseista. SDS-PAGE-geelit visualisoitiin Coomassie Bluella. FTSQBL heteroheksameeri (3 mg/mL, vaaleanvihreä viiva), ftsqbl heterotrimeeri (3 mg/mL, punainen viiva), ftsqb (10 mg/mL, sininen viiva) ja ftsq (10 mg/mL, musta viiva) analysoitiin SEC-MALS-menetelmällä. Paksu viiva edustaa mitattua molekyylimassaa. D) ftsq50–276: n edustavat bli–määritykset ftsb25–103: n, FtsB61–103: n ja FtsB25-60: n kanssa. Bli sensorgrams, jossa on eri pitoisuuksia analyyttejä, ilmaistaan eri väreillä. Tasapainoanalyysi ja laskettu KD esitetään kullekin konstruktiolle oikeissa paneeleissa. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

Ftsq-FtsB-kompleksin kiderakenne

saadaksemme lisää tietoa ftsqb-kompleksin rakenteellisesta organisoinnista määritimme ftsq50–276: n 2.9–Å-resoluutiorakenteen, joka on sidottu FtsB25-103: een (Kuva. 2, Täydentävä Kuva. S3 ja taulukko 1). Elektronitiheyskarttaa jäännöksistä 25-60 ei havaittu ftsb25–103: lle, kun taas lähes kaikki sekvenssit ftsq50–276 todettiin järjestetyiksi lukuun ottamatta N – ja C-terminaalisia joustavia alueita (jäännökset 50-52 ja 262-276, vastaavasti; Fig. 2A ja täydentävä Kuva. S3). Johdonmukaisesti, elektronitiheyskartta Ftsb N-terminus (jäämät 22-63) ei havaittu ftsb kiderakenne ftsqb monimutkainen, joka raportoitiin äskettäin muu ryhmä 26. Yksi mahdollisuus elektronitiheyden puuttumiseen on se, että kalvo-proksimaalinen helix on epäjärjestyksessä ftsqb-kompleksin kiteessä; kuitenkin ftsb: n 30 juxta-kalvon aminohapon kiderakenne osoitti, että se muodostaa kanonisen kietoutuneen coil27: n, joten suljimme tämän mahdollisuuden pois. Toinen mahdollisuus on, että kalvo-proksimaalinen helix halkeaa automaattisesti puhdistuksen ja kiteytymisen aikana siten, että jäljelle jäävä konstruktio (FtsQ50–276-FtsB61–103) kiteytyy helposti. Koska ftsqbl-kompleksin aiemmat molekyylidynamiikkasimulaatiot osoittivat, että Ftsb: n keskiosassa Leu60: n jäännöksen ympärillä on helix-break28, ennustimme, että Ftsb: n keskiosa Leu60: n ympärillä on altis proteolyysille.

kuva 2

ftsq50–276/FtsB25–103-kompleksin yleinen rakenne. (A) Stereo nauha kaaviot FtsQB monimutkainen. Jäännösten elektronitiheyskartta 61-95 havaittiin vain ftsb25–103: lle. Jokainen ketju on esitetty eri väriä. (B,C) suurennettu stereonäkymä, joka näyttää yksityiskohdat vuorovaikutuksesta ftsq: n ja FtsB: n rajapinnassa. Jokainen ketju on esitetty eri väriä.

Taulukko 1 tiedonkeruu-ja tarkennustilastot.

ftsq50–276: n Kokonaisrakenne koostuu kahdesta domeenista, α Ja β, Ja β-domeeni vastaa ftsb25–103: n sitomisesta (Fig. 2 A). Ftsq: n ja FtsB: n rajapintaan haudattu liuotinpinta-ala oli 1330 Å2, noin 20% ftsq: n monomeeripinta-alasta. Lisäksi noin 50% ftsq: n ja FtsB: n rajapinnan ei-vetyatomeista on polaarisia, kuten proksimaalisen isoavelocityn pinta-alalaskelmat 29 osoittavat. Ftsb-sekvenssi (jäämät 61-95) taittuu yhteen α-kierteeseen (α3) ja yhteen β-säikeeseen (β1; Fig. 2 A). Α-helix-turn-β-juosteen motiivi alkaa α-kierteellä (jäännökset 64-75), jota seuraa kinked-silmukka (jäännökset 76-82), lyhyt β-juoste (jäännökset 83-85) ja toinen terminaalinen kinked-silmukka (jäännökset 86-95; Kuva. 2C); kaksi kierteistä silmukkaa sisältävät kaksi proliinijäämää (Pro80 ja Pro89; Kuva. 2C). Mielenkiintoista on, että ftsq α5 helix omaksuu kinkkisen muodon sisällyttämällä Pro228: n keskelle ja tämä muoto näyttää olevan ratkaiseva sen laajoille yhteyksille FtsB: n kanssa. Kun Tyr edeltää aminohapposekvenssissä Prota, se lisää Pro-jäännöksen taipumusta ottaa cis-konformaatio30; Ftsq: n pro228-jäämä hyväksyy kuitenkin trans-konformaation (Kuva. 2C).

Ftsq: n Sidontatilat kompleksissa FtsB: n kanssa

vaikka aikaisempi massaspektrometrinen analyysi kuvallisella ristisilloituksella osoitti, että FtsQ: n ja FtsB: n C-terminaaliset alueet ovat ratkaisevia vuorovaikutuspisteitä, massaspektrometrisen analyysin ehdottamat yksityiskohtaiset vuorovaikutukset poikkesivat täysin kiderakenteessamme havaituista vuorovaikutuksista (Kuva. 2). Massaspektrometrisen analyysin perusteella esitettiin, että FtsB: n C-terminaali Met77-jäämän ympärillä muodostaa β-levyn kaltaisen vuorovaikutuksen Ftsq: n C-terminaalijuoman kanssa Gly255-jäännöksen 23 ympärillä. Toisin kuin nämä tiedot, kiderakenteemme osoitti, että ftsb: n met77-jäännöksen ympärillä oleva alue ei muodostanut sekundaarirakennetta, ja sen sivuketjun suunta on päinvastainen kuin ftsq: n odotettu sitova alue (Kuva. 2C). Kiderakenteessamme FtsB: n C-terminaalinen alue (jäämät 61-103) vuorovaikuttaa laajasti ftsq: n β-domeenin kanssa ja edistää pääasiassa FtsQ: n sitoutumista. Α-helixin (jäämät 64-75) ja β-juosteen (jäämät 83-85) välinen kiertosilmukka kiertää Ftsq: n tyr248-jäännöksen (Kuva. 2b). Kiertyneen silmukan konformaation vakauttamiseksi neljä FtsB-jäännöstä (Glu68, Arg72, Arg79 ja Glu82) muodostavat klusterin, jossa on laajat suolasiltaverkot (Kuva. 3 A). FtsB Glu68 muodostaa suolasillan sekä Arg72: n (2,8 Å) että Arg79: n (2,8 Å) kanssa, kun taas Arg72 muodostaa suolasillan Glu82: n (2,8 Å ja 3.0 Å, vastaavasti; Kuva. 3a); Arg72 NH2-atomi muodostaa yhden ylimääräisen vuorovaikutuksen Glu68 OE2-atomin kanssa (2,8 Å; Kuva. 3 A). Ftsb: n suolasiltaklusteri on ratkaiseva vetysidoksen muodostumisessa (2,7 Å) FtsQ Tyr248: n happiatomin ja Ftsb Arg72: n NH1-atomin välillä (Kuva. 3 A). Lisäksi ftsb Glu69 muodostaa suolasillan ftsq Arg196: n (2,3 Å; Fig. 3 A). Mielenkiintoista on, että ftsb: n β-juoste tekee jatkuvan β-arkin ftsq: n kanssa anti-rinnakkaisella pinoamisella β12: n kanssa (kuva. 2C). FtsB Phe84 muodostaa läheisen yhteyden Ftsq Tyr248: n kanssa, kun taas Tyr85 sijaitsee lähellä ftsq β-domeenin hydrofobista ydintä, joka koostuu Leu226: sta, Leu230: sta, Val254: stä ja Trp256: sta (Kuva. 2b). FtsB Leu87 muodostaa myös laajat yhteydet Ftsq Leu226: een ja Arg222: n alifaattiseen osaan (Kuva. 2C).

kuva 3

Ftsqb-kompleksin molekyylien vuorovaikutukset yksityiskohtaisesti. (A) suurennetut näkymät, jotka osoittavat yksityiskohtaiset vuorovaikutukset ftsq: n ja FtsB: n rajapinnoissa. Näytetään ftsb: n nauhakaaviot ja ftsq: n pintakaaviot. Punaiset pinnat osoittavat 100% säilyneitä jäämiä FtsQ :sta(täydentävä Kuva. S2). B) Ftsq-FtsBL-kompleksin WT: n ja mutanttien edustavat bli-määritykset (FTSQ Y248A, FTSB E68A, FtsB E69R, FtsB R72E ja FTSB E82R). Bli sensorgrams, jossa on eri pitoisuuksia analyyttejä, ilmaistaan eri väreillä. Tasapainoanalyysi ja laskettu KD esitetään kullekin konstruktiolle oikeissa paneeleissa.

ftsqb-kompleksin interfacial-jäämien osuuden arvioimiseksi mutatoitiin ftsq: n (Tyr248) ja FtsB: n (Glu68, Glu69, Arg72 ja Glu82) interfacial conserved residues-jäämät ja BLI tutki niiden yhteisvaikutukset. Ftsq: n ja FtsB: n välinen sitovuus mitattiin immobilisoimalla villityyppisiä (WT) tai GST-e5-FtsB: n mutantteja kompleksissa k5-FtsL: n kanssa. Kuten odotettiin, interfacial jäämien mutaatio johti suureen affiniteetin vähenemiseen verrattuna WT: hen (KD = 0, 24 µM). Y248a-mutantin KD-arvoa ei voitu mitata heikon sitoutumisen vuoksi, kun taas e68a vähensi affiniteettia noin 10-kertaiseksi (Kuva. 3b). Ftsb: n varauksen käänteismutaatiot E69R, R72E ja E82R lähes lakkasivat sitoutumasta FtsQ: Hon (Kuva. 3b). Tämä korostaa ftsq Tyr248: n ja ftsb: n α-helix-turn-β-strand-Motifin roolia affiniteetin taustatekijöinä.

FtsQ: n ja FtsB: n rajapinta in vivo

ftsb: n ja FtsQ: n periplasmisten alueiden in vitro sitoutumisen varmistamiseksi suoritimme bakteeriperäisen kaksihybridimäärityksen, joka perustui sykliseen AMP-signalointiin cascade31. Koska T18 – tai T25-fuusioidun FTS-proteiinin n-terminus oli myrkyllistä E. coli-bakteerille ja sillä on jonkinasteinen epävakausongelma, rakensimme C-terminus-fuusioidut Fts-proteiinit (T25-FtsQ, T18-FtsB)18. E. coli BTH101-reportterikanta muuntui samanaikaisesti osoitettujen plasmidien kanssa ja sitoutumistehokkuus määritettiin β-galaktosidaasimäärityksellä (Kuva. 4 A). Kuten kuvassa. 4A, WT FtsB, ja WT FtsQ vuorovaikutuksessa keskenään. Vastaavassa bli-määrityksessä FtsB (E68A) voi sitoutua WT FtsQ: han, kun taas sitoutumisaffiniteetti pieneni noin kaksinkertaiseksi verrattuna WT FtsB: hen. Mutatoituneet proteiinit FtsB: tä (E68A) lukuun ottamatta vähensivät niiden kykyä vuorovaikutukseen WT FtsQ: n kanssa. Se on yhtäpitävä in vitro-sitoutumistulosten kanssa, mikä osoittaa, että ftsq: n (Y248) ja FtsB: n (E69, R72 ja E82) interfacial-jäämillä on tärkeä rooli ftsqb-kompleksin muodostumisessa.

Kuva 4

Ftsqb-kompleksin molekyylien yhteisvaikutukset in vivo. (A) mutaatioiden vaikutus ftsq: n ja FtsB: n rajapinnoilla. Osoitetut plasmidiparit kulkeutuivat toimittajakantaan E. coli BTH101. Ftsb: n ja FtsQ: n yhteisvaikutukset arvioitiin bakteerien muodostaman kahden hybridin järjestelmän avulla. Sitoutumisaktiivisuus mitattiin β-galaktosidaasimäärityksellä ja esitettiin Millerin yksikkönä. Ф, backbone plasmid; B, ftsB; Q, ftsQ; *p < 0, 05, **p < 0, 005 verrattuna ryhmään, joka ilmaisee T18-sulatettua WT-FtsB-proteiinia ja T25-sulatettua FtsQ-proteiinia. B) WT: n ja mutatoitujen proteiinien välisen stabiilisuuden Vertailu. E. coli MG1655, jossa on plasmidi pUHE21-2-lacIq, joka koodaa C-terminaalista His-merkittyä WT-proteiinia tai mutatoitunutta proteiinia, otettiin näytteeksi ilmoitettuina ajankohtina kloramfenikolin lisäämisen jälkeen ja altistettiin Western-blottaukselle. Dnak: ta käytettiin lastausohjauksena. C) pistemutaatioiden in vivo-vaikutus FtsQ: hen ja FtsB: hen. WT: n ja mutatoituneiden proteiinien toimintaa arvioitiin peptidikonjugoidulla PNA: lla (PPNA). E. coli MG1655-kantoja, joissa oli mainitut plasmidit, käsiteltiin PPNA: lla, joka on täydentävä sekvenssi E. coli-kromosomissa, mutta ei ilmoitetuissa plasmideissa. CFUs-arvot mitattiin 3 h PNA-käsittelyn jälkeen. Merkittävät PMY-erot on osoitettu verrattuna kontrolliryhmään, joka ilmaisee WT ftsB: tä tai ftsQ: ta. * p < 0, 05, **p < 0, 005, N. S. ei merkitsevä verrattuna ftsB: hen; # p < 0, 05 verrattuna ftsQ: han; N. T. ei hoidettu.

ftsq: n ja FtsB: n välinen vuorovaikutus on tarpeen FTS: n loppupään proteiinien rekrytoimiseksi. Kun FtsQ tai FtsB on tyhjentynyt tai siihen liittyy haitallinen mutaatio, se johtaa filamentaatioon ja lopulta solujen kuolemaan. Ftsqb: n interfacial-jäämien in vivo-toiminnan arvioimiseksi suoritimme elinkykytestin soluille, jotka ilmentävät WT: tä tai mutatoituneita proteiineja peptidinukleiinihapoilla (PNAS). Aiempi tutkimus osoitti,että välttämättömiin geeneihin kohdistuvilla peptidikonjugoiduilla PNAS-bakteereilla (PPNAs) oli bakterisidisia vaikutuksia E. coli-soluihin 32,33, 34. Ribosomien sitoutumiskohdan tiedetään olevan tärkeä translaatiota estävä PNA-kohde 32. Koska PNA: n tiukka sitoutuminen mRNA: han häiritsee ribosomien toimintaa, proteiinin translaatio estyy33. Näiden periaatteiden pohjalta suunnittelimme neljä antisense Ppnaa, jotka täydentävät ftsb: n ja ftsQ: n käännösaloitteita (Supplementary Fig. S4). E. coli MG1655-kannan kasvua mitattiin antisense PPNA1, PPNA2, PPNA3 ja PPNA4: n estävien vaikutusten tutkimiseksi. ftsB-kohteena oleva PPNA1 ja FTSQ-kohteena oleva PPNA3 estivät voimakkaasti E. coli-bakteerin kasvua ja filamentoitumista (täydentäviä viikunoita S4 ja S5). Niinpä käytimme PPNA1 ja PPNA3 lisäkokeita. Rakensimme indusoituvia plasmideja, jotka ilmentävät WT FtsB: tä, WT FtsQ: ta, FtsB-mutantteja (E68A, E69R, R72E ja E82R) ja FtsQ-mutantteja (Y248A). Koska käytetyillä Ppnoilla ei ole komplementaarisia sekvenssejä rekombinanttiplasmidien kanssa, ne eivät häiritse proteiiniekspressiota plasmideissa. WT: tä tai mutatoituneita proteiineja ilmentävissä kannoissa ei havaittu merkittäviä eroja pesäkkeitä muodostavissa yksiköissä (PMY) 3 tunnin kohdalla ilman PPNA: ta. Plasmidissa olevat WT-proteiineja (FtsB tai FtsQ) ilmentävät solut ottivat talteen bakteerikasvun, kun niitä käsiteltiin PPNA: lla, mutta mutatoitunutta proteiinia ilmentävä solu ei toipunut kasvusta lukuun ottamatta FtsB: tä (E68A) (Kuva. 4c). Filamentaatiota havaittiin myös bakteereilla, jotka ilmentävät mutatoituneita proteiineja, joilla ei ole kykyä palauttaa kasvua, kun niitä hoidetaan PPNA: lla (Supplementary Fig. S5). Jotta voitaisiin sulkea pois mahdollisuus, että proteiinin stabiilisuus voisi vaikuttaa mutatoituneen proteiinin toimintaan, määritimme myös In vivo proteiinin stabiilisuuden estämällä de novo-proteiinisynteesiä. Plasmidi, joka koodaa ftsb: tä tai FtsQ: ta fuusioituneena merkkeihinsä C-terminuksessa, tuotiin E. coli MG1655: een, ja mutatoituneen proteiinin stabiilisuutta verrattiin WT FtsB: hen tai FtsQ: hon (Kuva. 4B ja täydentävä Kuva. S6). Tämän seurauksena mutatoituneet proteiinit FtsB: tä (E68A) lukuun ottamatta osoittivat samanlaisia tuloksia kuin WT. Vaikka FtsB (E68A) oli epävakaa verrattuna WT FtsB: hen, tämä mutatoitunut proteiini FTSB (E68A) voi täydentää WT FtsB: n toimintaa ja olla vuorovaikutuksessa FtsQ: n kanssa. Yhdessä se viittaa siihen, että ftsq: n (Y248) ja FtsB: n (E69, R72 ja E82) interfacial conservated residues-mutaatiot eivät vaikuta proteiinin stabiiliuteen vaan poistavat ftsb: n ja FtsQ: n välisen vuorovaikutuksen.

ftsqb: n ja ftsqbl: n Oligomeeriset tilat liuoksessa

aiemmin on raportoitu ristiriitaisia tuloksia FtsQ-proteiinin oligomeerisesta tilasta. Ftsq: n dimerisaatiota transmembraanialueen kautta (tai C-terminaalinen 30-jäämiä) havaittiin bakteeriperäisessä kahden hybridin kokeessa18,35. Sitä vastoin suora koe ftsq: n oligomeerisen tilan määrittämiseksi liuoksessa suoritettiin analyyttisellä ultracentrifugoinnilla, mikä osoitti, että FtsQ on monomeeri19. Emme kuitenkaan voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että ftsq: n transmembraanialue vaikuttaa ftsq: n oligomerisoitumistilaan, koska analyyttinen ultracentrifugaatiokoe suoritettiin ftsq19: n periplasmisella alueella. Vaikka käytimme myös ftsq: n, FtsQB: n ja FtsQBL: n periplasmisia alueita, oletimme, että niiden oligomeeriset tilat liuoksessa riippuvat pitoisuudesta ja että edelleen oligomerisaatiota voi esiintyä suurina pitoisuuksina. Ftsq: n, FtsQB: n tai ftsqbl: n pitoisuusriippuvaisten oligomeeristen tilojen analysoimiseksi liuoksessa suoritettiin analyyttinen geelisuodatus Superdex 200 (10/300 GL)-kolonnilla ja kokeellisia Stokes-säteitä (RH) verrattiin rakennemalleista laskettuihin (täydentävä Kuva). S7). Ftsq: n, FtsQB: n ja FtsQBL: n rakennemallit Rh-arvojen laskemiseksi luotiin ftsqb: n kiderakenteen ja FTSQBL: n saxs-rakenteen perusteella alla kuvatulla tavalla. Ftsq: n, FtsB: n ja FtsL: n n – ja C-Terminin näkymättömät segmentit mallinnettiin joustavina silmukoina (Supplementary Fig. S7).

suurilla ja pienillä ftsq50–276–pitoisuuksilla (370 ja 18, 5 µM) näennäinen RH (3, 03 ja 2, 83 nm) oli lähempänä ftsq50-276-monomeerin teoreettista RH: ta (2, 90 nm), mikä viittaa siihen, että ftsq esiintyy pääasiassa monomeerina liuoksessa (Kuva. 5). Sen sijaan ftsqb-kompleksin näennäinen RH (4,33 nm) oli lähempänä 2:2 ftsqb-heterotetrameerin (4,87 nm) arvoa korkeina pitoisuuksina (138 µM), kun taas näennäinen RH (3,12 nm) oli lähempänä 1:1 ftsqb-heterodimeerin (3,49 nm) arvoa pieninä pitoisuuksina (8 µM; Fig. 5). Ftsqb:n heterotetrameerimallin 2: 2 tukemiseksi ftsqb: n molekyylipaino korkeina pitoisuuksina (138 µM) mitattiin koon poissulkukromatografialla monikulman valon sironnalla (sec-MALS). Itse asiassa ftsqb:n molekyylimassa oli yhdenmukainen FtsQ: n ja FtsB: n 2: 2-kompleksin kanssa (kuva. 1C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että FtsB välittää ftsqb: n dimerisaatiota, koska ftsq on olemassa monomeerina suurina ja pieninä pitoisuuksina. Ftsqbl-kompleksissa heteroheksameriset ja heterotrimeeriset muodot eluoitiin erikseen geelisuodatuksessa puhdistuksen aikana ja ne kerättiin erikseen. Jokainen muoto oli vakaa, kuten SEC-MALS (Kuva. 1C), ja sitä käytetään edelleen analyyttisen geelisuodatuksen analysointiin. Ftsqbl–kompleksin suurilla ja pienillä pitoisuuksilla (6,8-20 µM ja 101-200 µM) heteroheksamerisen FtsQBL:n näennäiset Rh-arvot olivat lähempänä 2: 2: n arvoja.:2 FtsQBL-malli (5,59 nm), kun taas heterotrimeerisen FtsQBL:n RH-arvot olivat lähempänä 1:1: 1 FtsQBL-mallin (4,28 nm) (Fig. 5). Tämä viittaa siihen, että sekä ftsqbl: n heteroheksameriset että heterotrimeeriset muodot esiintyvät stabiilissa muodossa sen pitoisuuksista riippumatta.

kuva 5

Ftsq50-276/FtsB25–103: n Pitoisuusriippuvainen oligomerisaatio. A) analyyttiset geelisuodatusprofiilit, joissa on ftsq50–276 (violetti), ftsq50–276/FtsB25–103 (punainen), ftsqbl heterotrimeeri (vaaleanvihreä) ja ftsqbl heteroheksameeri (tummanvihreä) korkeina (101-370 µM; kiinteät viivat ja vasen y-akseli) ja matalina (6,8–20 µM; katkoviivat ja oikea y-akseli) pitoisuuksina. (B) tiivistelmä hydrodynaamisesta analyysista Fig. 5A. Rh-arvoja sarakkeesta verrattiin rakennemalleista laskettuihin arvoihin (Supplementary Fig. S7) HYDROPRO-ohjelman avulla.

Ftsqb-tetrameerin rakenteellinen organisaatio

seuraavaksi tarkastelimme ftsqb-heterotetrameerin rakenteellista organisaatiota liuoksessa. Kun arvioimme ftsqb-kompleksin kidepakkausta, mahdollinen ftsqb-heterotetrameeri syntyi kristallografisten symmetriaoperaatioiden kautta ja sillä oli pitkänomainen rakenne, jonka kokonaismitat olivat 30 × 40 × 150 Å, siten, että ftsqb-heterodimeeri dimerisoitui antiparallel-tavalla päästä päähän ftsq-alayksiköiden n-terminaalisten α-domeenien kautta (täydentävä Kuva. S7C). Vaikka spekuloimme, että ftsqb muodostaa suuremman oligomeerin ftsb: n kautta analyyttisten geelisuodatustietojen perusteella, emme voineet sulkea pois mahdollisuutta, että ftsqb-heterotetrameeri liuoksessa muodostui samasta rajapinnasta, joka havaittiin kidekosketuksessa. Näin tutkimme, osallistuuko kristallografinen rajapinta ftsqb-heterotetrameerin muodostamiseen. Ftsq: n dimeerirajapinnassa tiukasti säilyneet Leu57-ja Phe87-jäämät muodostavat rajapinnassa hydrofobisen ytimen (täydentävä Kuva. S2A); siksi oletimme, että ftsqb L57R tai F87A-mutantti on olemassa heterodimeerinä riippumatta sen pitoisuudesta, jos Leu57 ja Phe87 ovat ratkaisevia jäämiä ftsqb-heterotetrameerin kokoamisessa. Kuitenkin sekä L57R – että F87A-mutantit koottuina 2: 2-heterotetrameeriksi vain suurina pitoisuuksina (täydentävä Fig. S8), mikä viittaa siihen, että liuoksessa havaittu ftsqb-heterotetrameeri ei muodostunut FtsQ-alayksiköiden n-terminaalisten α-domeenien kautta.

seuraavaksi hypoteesimme, että ftsb: n kelattu Kelan alue on vastuussa ftsqb-heterodimeerien dimerisoitumisesta. Tässä tapauksessa ennustimme, että ftsqb: n helix-breaking L46P-mutantti estää ftsqb-heterodimeerien dimerisaation. Itse asiassa jotkut osat FtsQB L46P mutantti koota 1: 1 heterodimers, jopa suurina pitoisuuksina (täydentävä Kuva. S8). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ftsb: n kelattu Kelan alue on ratkaiseva ftsqb-heterotetrameerin kokoonpanolle liuoksessa. Vuonna 2:2 ftsqb heterotetrameeri malli, N-terminaali suuntiin sekä FtsB alayksiköt ovat suuntautuneet samaan suuntaan, ja siten transmembrane alue FtsB voi myös dimerisoida helpottaa homodimerisaatio täyspitkä FtsB. Tämä saattaa selittää sen, miksi ftsqb: n oligomerisoitumista havaittiin vain suurina pitoisuuksina. Yhdenmukaisesti havaintojemme, aiempi tutkimus raportoi, että FtsB itse associates kautta periplasmic coiled coil ja transmembrane regions26. Suurilla ja pienillä E5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121-pitoisuuksilla (191 ja 22, 2 µM) näennäinen RH (molemmat 4.50 nm) oli lähempänä E5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121:n 2: 2-heterotetrameerin teoreettista RH: ta (4,38 nm), mikä viittaa siihen, että e5–FtsB25-103/k5–FtsL64-121 esiintyy pääasiassa heterotetrameerina liuoksessa (täydentävä Kuva. S8). Yhtäpitävästi tämän kanssa osoitti myös tuore tutkimus, jossa käytettiin FRET-analyysia ja laskennallisia menetelmiä, että ftsbl-kompleksi muodostaa tetramer36: n.

SAXS structure of FtsQBL complex

the overall conformation of the ftsqbl complex in solution, SAXS data were collected. 1:1:1 tai 2:2:2 FtsQBL-kompleksia käytettiin molekyylikuoren ab initio-rakenteen määrittämiseen pienillä ja suurilla pitoisuuksilla (Fig. 6A ja täydentävä Kuva. S9). Mielenkiintoista on, että ftsqbl 2:2:2-kompleksin yleinen kirjekuori osoitti pitkänomaisen ”Y” – muodon (kuva. 6 A). Vaikka kirjekuoressa ei ollut riittävästi yksityiskohtia ftsq: n, FtsB: n ja FtsL: n yksittäisten verkkotunnusten sijoittamiseksi, huomasimme, että suuri kirjekuori, jossa on kovera pinta, sopii kohtuullisen hyvin ftsq: n muotoon (Kuva. 6 A). Jotta kaksi ftsq-molekyyliä voitaisiin sisällyttää koveraan kuoreen, Ftsq: n ja FtsBL: n n-terminaalisuuntien tulisi olla vastakkaiset. Tämä oli odottamatonta, sillä muiden ryhmien muodostamissa aiemmissa malleissa oli N-terminaaliset transmembraaniheleksit, jotka olivat suuntautuneet samaan suuntaan20. Ftsq50–276/FtsB25–103-kompleksin kiderakenne liitettiin onnistuneesti molekyylikuoreen (Fig. 6A ja täydentävä Kuva. S9), mikä osoittaa, että ftsq50–276-FtsB25–103-kompleksin yleinen konformaatio on liuokseltaan melko jäykkä. Lisäkuori määrättiin heterotetrameerisen kelan ja FtsBL e5 – ja k5-kelojen asentoihin (Kuva. 6 A). Äskettäin ehdotettiin, että FtsBL-alikompleksi on 2:2-heterotetrameeri, jossa on keskeytymätön ftsl-helix, joka yhdistää transmembraanin ja periplasmisen coil36: n; siksi Y-muotoinen FtsQBL saattaa sopia hyvin kaarevan kalvon kalvokiinnitykseen (Kuva. 6b). SAXS-kuoren alhaisen resoluution vuoksi FtsQBL: n rakenteellista kokoonpanoa oli vaikea määritellä selkeästi, minkä vuoksi tarvitaan lisää rakenteellista määritystä. Vaikka havaitsimme 2:2 ftsqb heterotetrameeri ja 2: 2: 2 ftsqbl heteroheksameeri muodostumista in vitro, onko nämä muodot olemassa In vivo jää epäselväksi ja lisätutkimuksia tarvitaan paljastaa fysiologinen Stoikiometria divisome. On kuitenkin huomattava, että FtsQBL oli aiemmin ehdotettu muodostaa 2:2:2 monimutkainen on divisome37. Vaikka lisätutkimuksia tarvitaan ftsqbl: n rakenteellisen organisoinnin ymmärtämiseksi divisomen kokoonpanossa, tietomme antavat pohjan jatkotutkimuksille.

kuva 6

SAXS ratkaisu rakenne FtsQBL ja kokonaismalli FtsQBL monimutkainen. (A) SAXS solution structures of FtsQBL 1:1:1 trimer and 2:2:2 heksamer. Ftsqbl-kompleksien (1:1:1 ja 2:2:2) rakennemallit rekonstruoitiin käyttämällä ab initio-muodon määritysohjelmaa DAMMIF. Kullekin proteiinille luotiin 10 itsenäistä mallia, vertailtiin ja laskettiin keskiarvomalli damaver-ohjelman avulla. Rakennemallien pintarenderointi saavutettiin pymol-ohjelmalla. Ftsqbl-proteiinien atomimallien nauhakaavio verrattiin supcomb-ohjelman avulla rekonstruoituihin nukkeatomimalleihin. NSD = 7.039 mallille 1:1:1 ja 3.800 mallille 2: 2: 2. (B) Y-muotoisen FtsQBL: n kokonaismalli. Ftsqbl ry rekrytoimalla ftsbl complex ftsq näkyy. Jokainen ketju on edustettuna eri värillä.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.