Informations structurelles sur le Complexe FtsQ / FtsB / FtsL, un composant clé du Divisome

Interactions intermoléculaires de FtsQ et de FtsB

Des études antérieures ont montré que le sous-complexe périplasmique de FtsB et de FtsL peut être reconstitué en remplaçant les régions membranaires des deux protéines par bobines enroulées solubles à charge opposée (e5 et k5 sur la Fig. 1A) 20,21,22. En utilisant cette technique, un complexe binaire stable (FtsBL) constitué de FtsB et de FtsL a été reconstitué en co-exprimant e5-FtsB25–103 et k5-FtsL64–121 dans des cellules d’E. coli (Fig. 1A et Fig. supplémentaires. S2). Le complexe ternaire (FtsQBL) constitué de FtsQ, e5-FtsB et k5-FtsL a été reconstitué en mélangeant une pastille de cellules humides contenant du FtsQ50-276 surexprimé et une pastille de cellules contenant du e5-FtsB25–103 et du k5-FtsL64–121 surexprimés. Les complexes FtsBL et FtsQBL ont été co-élués à partir d’une colonne d’affinité et co-migrés sur des colonnes d’exclusion de taille (Fig. 1B, C). Un complexe stable FtsQ50–276-FtsB25–103 a été formé (Fig. 1B), mais FtsQ n’avait pas d’affinité de liaison avec k5-FtsL64–121 en l’absence de e5-FtsB25–103 (données non présentées), ce qui est conforme à l’étude précédente20. Pour cartographier avec précision la région de liaison entre FtsQ et FtsB, deux constructions (FtsB25–60 et FtsB61–103) avec des régions tronquées N- ou C-terminales de FtsB25–103 ont été conçues et leurs interactions avec FtsQ50–276 ont été examinées dans une expérience d’interférométrie biocouche (BLI) (Fig. 1D). FtsQ50-276 lié au complexe FtsB25-103 avec une constante de dissociation (KD) de 0,67 µM (Fig. 1D). Parmi les deux constructions FtsB (FtsB25–60 et FtsB61–103), seule la liaison de FtsB61–103 à FtsQ50–276 était stable (KD = 0,9 µM), ce qui suggère que la région C-terminale de FtsB (principalement les résidus 61-103) contribue principalement à la liaison de FtsQ (Fig. 1D), en accord avec un résultat précédent selon lequel la terminaison C de FtsB est nécessaire pour l’interaction avec FtsQ25. Bien qu’une autre étude précédente ait suggéré qu’une région membrane-proximale de FtsQ soit un autre point chaud d’interaction pour la liaison ftsb23, la liaison stable de FtsQ50–276 avec FtsB25–60 n’a pas été observée dans notre expérience (Fig. 1D).

Figure 1

Mappage de la région de liaison FtsQ-FtsB-FtsL. (A) Architecture de domaine de FtsQ, FtsB et FtsL. Les constructions sont indiquées par des lignes grises et la reconstitution des FtsB et FtsL à l’aide de bobines e5 et k5 est indiquée. (B) PAGE SDS des complexes FtsQ50–276, FtsQ50–276/FtsB25–103 et FtsQ50–276/e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (FtsQBL). Les gels SDS-PAGE ont été visualisés à l’aide du bleu de Coomassie. (C) L’hétérohexamère FtsQBL (3 mg/mL, raie vert clair), l’hétérotrimère FtsQBL (3 mg/mL, raie rouge), le FtsQB (10 mg/mL, raie bleue) et le FtsQ (10 mg/mL, raie noire) ont été analysés par SECONDES. La ligne épaisse représente la masse moléculaire mesurée. (D) Essais BLI représentatifs de FtsQ50–276 avec FtsB25–103, FtsB61–103 et FtsB25–60. Les capteurs BLI avec différentes concentrations d’analytes sont indiqués par différentes couleurs. L’analyse de l’équilibre et le KD calculé sont affichés pour chaque construction sur les panneaux de droite. Les expériences ont été répétées trois fois.

Structure cristalline du complexe FtsQ-FtsB

Pour mieux comprendre l’organisation structurelle du complexe FtsQB, nous avons déterminé la structure de résolution de 2,9Å de FtsQ50-276 liée à FtsB25-103 (Fig. 2, Fig. supplémentaire. S3, et tableau 1). La carte de densité électronique des résidus 25-60 n’a pas été observée pour FtsB25-103, alors que presque toutes les séquences de FtsQ50-276 ont été ordonnées à l’exception des régions flexibles N et C terminales (résidus 50-52 et 262-276, respectivement; Fig. 2A et Fig. supplémentaires. S3). De façon constante, la carte de densité électronique de l’extrémité N-terminale du FtsB (résidus 22-63) n’a pas été observée pour le FtsB dans la structure cristalline du complexe FtsQB, ce qui a été signalé récemment par d’autres groupes26. Une possibilité concernant le manque de densité électronique est que l’hélice membrane-proximale est désordonnée dans le cristal du complexe FtsQB; cependant, la structure cristalline des 30 acides aminés juxta-membrane de FtsB a montré qu’elle forme un enroulement canonique 27, nous avons donc exclu cette possibilité. Une autre possibilité est que l’hélice membrane-proximale soit clivée automatiquement lors de la purification et de la cristallisation, de sorte que la construction restante (FtsQ50–276-FtsB61–103) cristallise facilement. Étant donné que des simulations de dynamique moléculaire antérieures du complexe FtsQBL ont montré que la partie centrale de FtsB autour du résidu Leu60 présente une rupture d’hélice 28, nous avons prédit que la partie centrale de FtsB autour de Leu60 est sujette à la protéolyse.

Figure 2

Structure globale du complexe FtsQ50–276 / FtsB25–103. (A) Diagrammes en ruban stéréo du complexe FtsQB. La carte de densité électronique des résidus 61-95 n’a été observée que pour FtsB25–103. Chaque chaîne est représentée dans une couleur différente. (B, C) Vue stéréo agrandie montrant les détails de l’interaction à l’interface de FtsQ et FtsB. Chaque chaîne est représentée dans une couleur différente.

Tableau 1 Statistiques de collecte et d’affinement des données.

La structure globale du FtsQ50-276 se compose de deux domaines, α et β, et le domaine β est responsable de la liaison du FtsB25–103 (Fig. 2 BIS). La surface accessible aux solvants enfouie à l’interface entre FtsQ et FtsB était de 1330 Å2, soit environ 20 % de la surface monomère de FtsQ. De plus, environ 50% des atomes de nonhydrogène dans l’interface entre FtsQ et FtsB sont polaires, comme l’indiquent les calculs de surface d’isovélocité proximale29. La séquence FtsB (résidus 61-95) se replie en une hélice α (α3) et un brin β (β1; Fig. 2 BIS). Le motif α-hélice-tour-brin β commence par l’hélice α (résidus 64-75), suivie d’une boucle pliée (résidus 76-82), d’un brin β court (résidus 83-85) et d’une autre boucle pliée terminale (résidus 86-95; Fig. 2C) ; les deux boucles pliées contiennent deux résidus de proline (Pro80 et Pro89; Fig. 2C). Fait intéressant, l’hélice α5 de FtsQ adopte une forme pliée en incorporant Pro228 au milieu et cette forme semble être cruciale pour ses contacts étendus avec FtsB. Lorsque Tyr précède Pro dans la séquence d’acides aminés, cela augmente la tendance du résidu Pro à prendre une conformation cis 30; cependant, le résidu Pro228 de FtsQ adopte une conformation trans (Fig. 2C).

Modes de liaison de FtsQ en complexe avec FtsB

Bien que l’analyse spectrométrique de masse précédente par photo-réticulation ait indiqué que les régions C-terminales de FtsQ et de FtsB sont des points chauds d’interaction cruciaux, les interactions détaillées proposées par l’analyse spectrométrique de masse étaient complètement différentes de celles observées dans notre structure cristalline (Fig. 2). Sur la base de l’analyse spectrométrique de masse, il a été suggéré que l’extrémité C de FtsB autour du résidu Met77 forme une interaction de type feuille β avec le brin C-terminal de FtsQ autour du résidu Gly25523. Contrairement à ces données, notre structure cristalline a montré que la région autour du résidu Met77 de FtsB ne formait pas de structure secondaire et que la direction de sa chaîne latérale était opposée à la région de liaison attendue de FtsQ (Fig. 2C). Dans notre structure cristalline, la région C-terminale de FtsB (résidus 61-103) interagit largement avec le domaine β de FtsQ et contribue principalement à la liaison de FtsQ. La boucle pliée entre l’hélice α (résidus 64-75) et le brin β (résidus 83-85) s’enroule autour du résidu Tyr248 de FtsQ (Fig. 2B). Pour stabiliser la conformation de la boucle pliée, quatre résidus FtsB (Glu68, Arg72, Arg79 et Glu82) forment un amas avec de vastes réseaux de ponts de sel (Fig. 3 BIS). FtsB Glu68 forme des ponts de sel avec Arg72 (2,8 Å) et Arg79 (2,8 Å), tandis qu’Arg72 forme un pont de sel avec Glu82 (2,8 Å et 3.0 Å, respectivement; Fig. 3A) ; l’atome Arg72 NH2 forme une interaction supplémentaire avec l’atome Glu68 OE2 (2,8 Å; Fig. 3 BIS). L’amas de pont de sel de FtsB est crucial dans la formation de liaisons hydrogène (2,7 Å) entre l’atome d’oxygène de FtsQ Tyr248 et l’atome NH1 de FtsB Arg72 (Fig. 3 BIS). De plus, FtsB Glu69 forme un pont de sel avec FtsQ Arg196 (2,3 Å; Fig. 3 BIS). De manière intéressante, le brin β de FtsB forme une feuille β continue avec celle de FtsQ par empilement anti-parallèle avec β12 (Fig. 2C). Le FtsB Phe84 forme des contacts étroits avec le FTSQ Tyr248, tandis que le Tyr85 réside à proximité du noyau hydrophobe du domaine β du FtsQ constitué de Leu226, Leu230, Val254 et Trp256 (Fig. 2B). FtsB Leu87 forme également des contacts étendus avec FtsQ Leu226 et la partie aliphatique d’Arg222 (Fig. 2C).

Figure 3

Interactions moléculaires du complexe FtsQB en détail. (A) Vues agrandies montrant des interactions détaillées aux interfaces FtsQ et FtsB. Les diagrammes en ruban de FtsB et les diagrammes de surface de FtsQ sont affichés. Les surfaces rouges indiquent 100% de résidus conservés de FtsQ (Fig. S2). (B) Tests BLI représentatifs du complexe FtsQ-FtsBL WT et des mutants (FtsQ Y248A, FtsB E68A, FtsB E69R, FtsB R72E et FtsB E82R). Les capteurs BLI avec différentes concentrations d’analytes sont indiqués par différentes couleurs. L’analyse de l’équilibre et le KD calculé sont affichés pour chaque construction sur les panneaux de droite.

Pour évaluer les contributions des résidus interfaciaux du complexe FtsQB, les résidus conservés interfaciaux de FtsQ (Tyr248) et de FtsB (Glu68, Glu69, Arg72 et Glu82) ont été mutés et leurs interactions ont été examinées par BLI. Les affinités de liaison entre FtsQ et FtsB ont été mesurées en immobilisant des mutants de type sauvage (WT) ou de GST-e5-FtsB en complexe avec k5-FtsL. Comme prévu, la mutation des résidus interfaciaux a entraîné de fortes réductions d’affinité par rapport au poids (KD = 0,24 µM). La valeur KD du mutant Y248A n’a pas pu être mesurée en raison d’une faible liaison, tandis que l’affinité de l’E68A a diminué d’environ 10 fois (Fig. 3B). Les mutations d’inversion de charge E69R, R72E et E82R de FtsB ont presque aboli la liaison à FtsQ (Fig. 3B). Cela met en évidence le rôle du FtsQ Tyr248 et du motif FTSB α-hélice-tour-brin β en tant que déterminants d’affinité.

Interface FtsQ et FtsB in vivo

Pour vérifier la liaison in vitro des régions périplasmiques de FtsB et de FtsQ, nous avons réalisé un dosage bactérien bi-hybride basé sur une cascade de signalisation d’AMP cyclique31. Comme l’extrémité N de la protéine Fts fusionnée T18 ou T25 était toxique pour E. coli et présentait un certain problème d’instabilité, nous avons construit des protéines Fts fusionnées à l’extrémité C (T25-FtsQ, T18-FtsB)18. La souche rapporteuse d’E. coli BTH101 a été co-transformée avec une paire de plasmides indiqués et l’efficacité de liaison a été déterminée par dosage de la β-galactosidase (Fig. 4 BIS). Comme le montre la Fig. 4A, WT FtsB et WT FtsQ interagissaient les uns avec les autres. De la même manière que le test BLI, le FtsB (E68A) peut se lier au FtsQ WT, tandis que l’affinité de liaison a été réduite d’environ deux fois par rapport au FtsB WT. Les protéines mutées, à l’exception de la FtsB (E68A), ont diminué leur capacité à interagir avec la FtsQ WT. Il est cohérent avec les résultats de liaison in vitro, indiquant que les résidus interfaciaux de FtsQ (Y248) et de FtsB (E69, R72 et E82) jouent un rôle important dans la formation du complexe FtsQB.

Figure 4

Interactions moléculaires du complexe FtsQB in vivo. (A) L’effet des mutations au niveau des résidus interfaciaux de FtsQ et de FtsB. Les paires de plasmides indiquées ont été introduites dans une souche rapporteuse E. coli BTH101. Les interactions du FtsB et du FtsQ ont été évaluées par le système bactérien à deux hybrides. Les activités de liaison ont été mesurées par dosage de la β-galactosidase et présentées en unité Miller. Ф, plasmide du squelette; B, ftsB; Q, ftsQ; *p < 0,05, ** p < 0,005 par rapport au groupe exprimant le FtsB en poids fondu T18 et la protéine FtsQ fondue T25. (B) Comparaison de la stabilité entre le poids et les protéines mutées. E. la bactérie coli MG1655 hébergeant le plasmide pUHE21-2-lacIq codant pour le poids marqué par His en C-terminal ou la protéine mutée a été échantillonnée aux points temporels indiqués après ajout de chloramphénicol et soumise au Western blot. DnaK a été utilisé comme contrôle de chargement. (C) L’effet in vivo des mutations ponctuelles sur FtsQ et FtsB. La fonction du poids et des protéines mutées a été évaluée par PNA conjugué peptidique (PPNA). Les souches d’E. coli MG1655 hébergeant les plasmides indiqués ont été traitées avec du PPNA, séquences complémentaires dans le chromosome d’E. coli mais pas dans les plasmides indiqués. Les UFC ont été mesurées après 3 h de traitement par PNA. Des différences significatives d’UFC sont indiquées par rapport au groupe témoin exprimant WT ftsB ou ftsQ. * p < 0,05, ** p < 0,005, N.S. non significatif par rapport au ftsB; #p < 0,05 par rapport au ftsQ; N.t. non traité.

L’interaction entre FtsQ et FtsB est nécessaire pour recruter des protéines Fts en aval. Lorsque le FtsQ ou le FtsB est épuisé ou introduit avec une mutation délétère, il entraîne une filamentation et éventuellement la mort des cellules. Pour évaluer la fonction in vivo des résidus interfaciaux FtsQB, nous avons réalisé un test de viabilité de cellules exprimant le poids ou des protéines mutées avec des acides nucléiques peptidiques (PNA). Une étude précédente a montré que les PNA conjugués aux peptides (PPNA) ciblant des gènes essentiels avaient des effets bactéricides sur les cellules d’E. coli 32,33,34. Le site de liaison du ribosome est connu pour être un site cible clé de l’ANP pour inhiber la traduction32. Comme la liaison étroite de l’ANP à l’ARNm interfère avec la fonction du ribosome, la traduction des protéines est empêchée33. Sur la base de ces principes, nous avons conçu quatre PPNA antisens qui sont complémentaires des sites d’initiation de la traduction de ftsB et ftsQ (Fig. S4). La croissance de la souche MG1655 d’E. coli a été mesurée afin d’examiner les effets inhibiteurs de PPNA1, PPNA2, PPNA3 et PPNA4 antisens. PPNA1 ciblant le ftsB et PPNA3 ciblant le ftsQ ont fortement inhibé la croissance bactérienne et la filamentation d’E. coli (Figures supplémentaires S4 et S5). Ainsi, nous avons utilisé PPNA1 et PPNA3 pour d’autres expériences. Nous avons construit des plasmides inductibles exprimant le poids FtsB, le POIDS FtsQ, les mutants FtsB (E68A, E69R, R72E et E82R) et le mutant FtsQ (Y248A). Les PPNA utilisés n’ayant pas de séquences complémentaires aux plasmides recombinants, ils n’interfèrent pas avec l’expression protéique dans les plasmides. Les souches exprimant des protéines en poids ou mutées n’ont montré aucune différence significative dans les unités formant colonie (UFC) à 3 h sans PPNA. Les cellules exprimant les protéines WT (FtsB ou FtsQ) dans le plasmide ont récupéré la croissance bactérienne lorsqu’elles étaient traitées avec du PPNA, mais la cellule exprimant la protéine mutée n’a pas récupéré la croissance à l’exception du FtsB (E68A) (Fig. 4C). De plus, une filamentation a été observée chez des bactéries exprimant des protéines mutées n’ayant pas la capacité de récupérer la croissance lorsqu’elles sont traitées avec du PPNA (fig. S5). Pour exclure une possibilité que la stabilité de la protéine puisse affecter la fonction de la protéine mutée, nous avons également déterminé la stabilité de la protéine in vivo en bloquant la synthèse de la protéine de novo. Le plasmide codant pour FtsB ou FtsQ fusionné avec Son étiquette à l’extrémité C a été introduit dans E. coli MG1655, et la stabilité de la protéine mutée a été comparée à WT FtsB ou FtsQ (Fig. 4B et Fig. supplémentaires. S6). En conséquence, les protéines mutées à l’exception de FtsB (E68A) ont montré des résultats similaires à ceux de WT. Bien que la FtsB (E68A) soit instable par rapport à la FtsB WT, cette protéine mutée FtsB (E68A) peut compléter la fonction de la FtsB WT et interagir avec la FtsQ. Pris ensemble, il suggère que les mutations des résidus conservés interfaciaux de FtsQ (Y248) et de FtsB (E69, R72 et E82) n’affectent pas la stabilité protéique mais abolissent l’interaction entre FtsB et FtsQ.

États oligomères de FtsQB et de FtsQBL en solution

Auparavant, des résultats contradictoires ont été rapportés pour l’état oligomère de la protéine FtsQ. Une dimérisation du FtsQ via sa région transmembranaire (ou résidus C-terminaux 30) a été observée dans une expérience bactérienne à deux hybridations18,35. En revanche, une expérience directe de détermination de l’état oligomère du FtsQ en solution a été réalisée en utilisant une ultracentrifugation analytique indiquant que le FtsQ est un monomère 19. Cependant, nous ne pouvons exclure la possibilité que la région transmembranaire de FtsQ affecte l’état d’oligomérisation de FtsQ, puisque l’expérience d’ultracentrifugation analytique a été réalisée en utilisant la région périplasmique de FtsQ19. Même si nous avons également utilisé les régions périplasmiques de FtsQ, FtsQB et FtsQBL, nous avons émis l’hypothèse que leurs états oligomères en solution dépendent de la concentration et qu’une oligomérisation supplémentaire peut se produire à des concentrations élevées. Pour analyser les états oligomères dépendants de la concentration de FtsQ, FtsQB ou FtsQBL en solution, une filtration analytique sur gel a été réalisée à l’aide d’une colonne Superdex 200 (10/300 GL) et les rayons de Stokes expérimentaux (RH) ont été comparés à ceux calculés à partir de modèles de structure (Fig. supplémentaire. S7). Des modèles de structure de FtsQ, FtsQB et FtsQBL pour calculer les valeurs d’HR ont été générés sur la base de notre structure cristalline de FtsQB et de la structure SAXS de FtsQBL, comme décrit ci-dessous. Les segments invisibles des terminaisons N et C de FtsQ, FtsB et FtsL ont été modélisés comme des boucles flexibles (Fig. S7).

Pour les concentrations élevées et faibles de FtsQ50-276 (370 et 18,5 µM, respectivement), l’HR apparent (3,03 et 2,83 nm, respectivement) était plus proche de l’HR théorique du monomère FtsQ50–276 (2,90 nm), ce qui suggère que le FtsQ existe principalement sous forme de monomère en solution (Fig. 5). En revanche, pour le complexe FtsQB, le RH apparent (4,33 nm) était plus proche de celui de l’hétérotétramère FtsQB 2: 2 (4,87 nm) à des concentrations élevées (138 µM), tandis que le RH apparent (3,12 nm) était plus proche de celui de l’hétérodimère FtsQB 1: 1 (3,49 nm) à de faibles concentrations (8 µM; Fig. 5). Pour soutenir davantage le modèle d’hétérotétramère FtsQB 2:2, la masse moléculaire de FtsQB à des concentrations élevées (138 µM) a été mesurée par chromatographie d’exclusion de taille avec diffusion de lumière multi-angles (SECONDES). En effet, la masse moléculaire de FtsQB était cohérente avec un complexe 2:2 de FtsQ et de FtsB (Fig. 1C). Ces résultats suggèrent que le FtsB médie la dimérisation du FtsQB puisque le FtsQ existe sous forme de monomère à des concentrations élevées et faibles. Pour le complexe FtsQBL, les formes hétérohexamériques et hétérotrimériques ont été éluées séparément à la filtration sur gel pendant la purification et elles ont été collectées séparément. Chaque forme était stable comme l’indiquent les SECONDES (Fig. 1C), et en outre utilisé pour l’analyse de la filtration sur gel analytique. Aux concentrations élevées et faibles du complexe FtsQBL (6,8–20 µM et 101-200 µM, respectivement), les valeurs apparentes de RH de FtsQBL hétérohexamérique étaient plus proches de celles du 2:2:2 modèle FtsQBL (5,59 nm), tandis que les valeurs d’HR du modèle FTSQBL hétérotrimérique étaient plus proches de celles du modèle FtsQBL 1:1:1 (4,28 nm) (Fig. 5). Cela suggère que les formes hétérohexamériques et hétérotrimériques de FtsQBL existent sous une forme stable quelles que soient ses concentrations.

Figure 5

Oligomérisation dépendante de la concentration de FtsQ50-276 / FtsB25-103. (A) Profils analytiques de filtration sur gel de FtsQ50–276 (violet), FtsQ50–276 / FtsB25–103 (rouge), hétérotrimère FtsQBL (vert clair) et hétérohexamère FtsQBL (vert foncé) à des concentrations élevées (101-370 µM; lignes continues et axe y gauche) et faibles (6,8-20 µM; lignes pointillées et axe y droit). (B) Résumé de l’analyse hydrodynamique de la Fig. 5A. Les valeurs d’HR de la colonne ont été comparées à celles calculées à partir de modèles de structure (Fig. S7) en utilisant le programme HYDROPRO.

Organisation structurelle du tétramère FtsQB

Nous avons ensuite examiné l’organisation structurelle de l’hétérotétramère FtsQB en solution. Lorsque nous avons évalué l’emballage cristallin du complexe FtsQB, un hétérotétramère potentiel de FtsQB a été généré par des opérations de symétrie cristallographique et présentait une structure allongée avec des dimensions hors tout de 30 × 40 × 150 Å, de sorte que l’hétérodimère de FtsQB se dimérise de manière antiparallèle tête à tête via les domaines α N-terminaux des sous-unités FtsQ (Figure supplémentaire. S7C). Bien que nous ayons émis l’hypothèse que le FtsQB forme un oligomère plus important via le FtsB sur la base des données analytiques de filtration sur gel, nous ne pouvions pas exclure la possibilité que l’hétérotétramère du FtsQB en solution ait été formé par la même interface observée dans le contact cristallin. Ainsi, nous avons examiné si l’interface cristallographique est impliquée dans la formation de l’hétérotétramère FtsQB. À l’interface dimère de FtsQ, les résidus Leu57 et Phe87 strictement conservés forment un noyau hydrophobe à l’interface (Fig. supplémentaire. S2A); par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que le mutant FtsQB L57R ou F87A existe sous forme d’hétérodimère quelle que soit sa concentration si Leu57 et Phe87 sont des résidus cruciaux pour l’assemblage de l’hétérotétramère FtsQB. Cependant, les mutants L57R et F87A ne se sont assemblés en un hétérotétramère 2:2 qu’à des concentrations élevées (Fig. S8), suggérant que l’hétérotétramère FtsQB observé en solution n’a pas été formé via les domaines α N-terminaux des sous-unités FtsQ.

Nous avons ensuite émis l’hypothèse que la région de bobine enroulée de FtsB est responsable de la dimérisation des hétérodimères de FtsQB. Dans ce cas, nous avons prédit qu’un mutant L46P à rupture d’hélice de FtsQB inhibe la dimérisation des hétérodimères de FtsQB. En effet, certaines portions du mutant FtsQB L46P s’assemblent en hétérodimères 1:1, même à des concentrations élevées (Fig. S8). Ces résultats suggèrent que la région de bobine enroulée de FtsB est cruciale pour l’assemblage de l’hétérotétramère FtsQB en solution. Dans le 2:2 Modèle hétérotétramère FtsQB, les directions N-terminales des deux sous-unités FtsB sont orientées dans la même direction, et donc la région transmembranaire de FtsB peut également se dimériser pour faciliter l’homodimérisation de FtsB pleine longueur. Ceci peut expliquer pourquoi l’oligomérisation d’ordre supérieur du FtsQB n’a été observée qu’à des concentrations élevées. Conformément à nos résultats, une étude précédente a rapporté que le FtsB s’associait par l’intermédiaire de la bobine enroulée périplasmique et des régions transmembranaires 26. Pour les concentrations élevées et faibles d’e5-FtsB25-103 / k5–FtsL64-121 (191 et 22,2 µM, respectivement), l’HR apparent (les deux 4.50 nm) était plus proche de l’HR théorique de l’hétérotétramère 2:2 de e5-FtsB25–103 / k5-FtsL64–121 (4,38 nm), suggérant que l’e5-FtsB25–103 / k5-FtsL64–121 existe principalement sous forme d’hétérotétramère en solution (fig. supplémentaire. S8). En accord avec cela, une étude récente utilisant l’analyse de FRET et des méthodes de calcul a également montré que le complexe FtsBL forme un tétramère 36.

Structure SAXS du complexe FtsQBL

Pour déterminer la conformation globale du complexe FtsQBL en solution, des données SAXS ont été collectées. Le 1:1:1 ou 2:2:Le complexe 2 FtsQBL a été utilisé pour déterminer la structure ab initio de l’enveloppe moléculaire à des concentrations faibles et élevées, respectivement (Fig. 6A et Fig. supplémentaires. S9). Fait intéressant, l’enveloppe globale du complexe FtsQBL 2:2:2 présentait une forme allongée en « Y » (Fig. 6 BIS). Même si l’enveloppe ne présentait pas suffisamment de détails pour positionner les domaines individuels de FtsQ, FtsB et FtsL, nous avons observé que la grande enveloppe à surface concave s’adaptait raisonnablement bien à la forme de FtsQ (Fig. 6 BIS). Pour incorporer les deux molécules de FtsQ dans la grande enveloppe à surface concave, les directions N-terminales de FtsQ et de FtsBL doivent être opposées. C’était inattendu car les modèles précédents formés par d’autres groupes possédaient des hélices transmembranaires N-terminales orientées dans la même direction20. La structure cristalline du complexe FtsQ50–276 / FtsB25–103 a été incorporée avec succès dans l’enveloppe moléculaire (Fig. 6A et Fig. supplémentaires. S9), indiquant que la conformation globale du complexe FtsQ50–276-FtsB25–103 est assez rigide en solution. L’enveloppe supplémentaire a été affectée aux positions de la bobine enroulée hétérotétramérique et des bobines FtsBL e5 et k5 (Fig. 6 BIS). Il a récemment été suggéré que le sous-complexe FtsBL est un hétérotétramère 2:2 avec une hélice FtsL ininterrompue reliant la bobine transmembranaire et la bobine enroulée périplasmique36; par conséquent, le FtsQBL en forme de Y peut bien s’insérer dans la membrane incurvée pour l’ancrage de la membrane (Fig. 6B). En raison de la faible résolution de l’enveloppe SAXS, il était difficile de définir clairement l’assemblage structurel de FtsQBL; par conséquent, une détermination structurelle plus poussée est nécessaire. Bien que nous ayons observé 2:La formation de l’hétérotétramère 2 FtsQB et de l’hétérohexamère 2: 2: 2 FtsQBL in vitro, l’existence de ces formes in vivo reste incertaine et d’autres études sont nécessaires pour révéler la stoechiométrie physiologique du divisome. Cependant, il convient de noter que FtsQBL a déjà été suggéré de former un complexe 2:2:2 à la divisome37. Bien que des études supplémentaires soient nécessaires pour bien comprendre l’organisation structurelle du FtsQBL dans l’assemblage divisome, nos données fournissent une base pour une enquête plus approfondie.

Figure 6

Structure de solution SAXS de FtsQBL et modèle global du complexe FtsQBL. (A) Structures en solution de SAXS du trimère FtsQBL 1:1:1 et de l’hexamère 2:2:2. Des modèles structuraux des complexes FtsQBL (1:1:1 et 2:2:2) ont été reconstruits en utilisant le programme de détermination de forme ab initio DAMMIF. Pour chaque protéine, 10 modèles indépendants ont été générés, comparés et un modèle moyen a été calculé à l’aide du programme DAMAVER. Le rendu de surface des modèles structurels a été réalisé à l’aide du programme PyMOL. Pour comparer les formes et les dimensions globales, le diagramme en ruban des modèles atomiques des protéines FtsQBL a été superposé aux modèles d’atomes fictifs reconstruits à l’aide du programme SUPCOMB. NSD = 7,039 pour le modèle 1:1:1 et 3,800 pour le modèle 2:2:2. (B) Modèle global de FtsQBL en forme de Y. L’association FtsQBL en recrutant le complexe FtsBL à FtsQ est montrée. Chaque chaîne est représentée dans une couleur différente.

Laisser un commentaire

Votre adresse e-mail ne sera pas publiée.