Intuizioni Strutturali il FtsQ/FtsB/FtsL Complesso, una Componente Chiave del Divisome

interazioni Intermolecolari di FtsQ e FtsB

studi Precedenti hanno mostrato che periplasmico subcomplex di FtsB e FtsL può essere ricostituito sostituendo la membrana regioni di entrambe le proteine con carica opposta, solubile coiled coil (e5 e il k5 in Fig. 1 BIS) 20,21,22. Utilizzando questa tecnica, un complesso binario stabile (FtsBL) costituito da FtsB e FtsL è stato ricostituito co-esprimendo e5-FtsB25–103 e k5-FtsL64–121 in cellule di E. coli (Fig. 1A e Fig. S2). Il complesso ternario (FtsQBL) costituito da FtsQ, e5-FtsB e k5-FtsL è stato ricostituito miscelando un pellet a cellule umide contenente FtsQ50–276 sovraespresso e un pellet a cellule contenenti e5-FtsB25–103 sovraespresso e k5-FtsL64–121. I complessi FtsBL e FtsQBL sono stati co-eluiti da una colonna di affinità e co-migrati su colonne di esclusione delle dimensioni (Fig. 1 TER, lettera C). È stato formato un complesso stabile FtsQ50–276-FtsB25–103 (Fig. 1B), ma FtsQ non aveva affinità di legame con k5-FtsL64-121 in assenza di e5–FtsB25-103 (dati non mostrati), coerente con lo studio precedente20. Per mappare con precisione la regione di legame tra FtsQ e FtsB, sono stati progettati due costrutti (FtsB25–60 e FtsB61–103) con regioni N – o C-terminali troncate di FtsB25–103 e le loro interazioni con FtsQ50–276 sono state esaminate in un esperimento di interferometria a biostrato (BLI) (Fig. 1D). FtsQ50-276 legato al complesso FtsB25-103 con una costante di dissociazione (KD) di 0,67 µM (Fig. 1D). Tra i due costrutti FtsB (FtsB25–60 e FtsB61–103), solo il legame FtsB61–103 con FtsQ50–276 era stabile (KD = 0,9 µM), suggerendo che la regione C-terminale di FtsB (principalmente residui 61-103) contribuisce principalmente al legame FtsQ (Fig. 1D), coerente con un precedente risultato che il C-terminale di FtsB è necessario per l’interazione con FtsQ25. Anche se un altro studio precedente ha suggerito che una regione membrana-prossimale di FtsQ è un altro hotspot di interazione per FtsB binding23, il legame stabile di FtsQ50-276 con FtsB25-60 non è stato osservato nel nostro esperimento (Fig. 1D).

Figura 1

Mappatura della regione di associazione FtsQ-FtsB-FtsL. (A) Architettura di dominio di FtsQ, FtsB e FtsL. Costrutti sono indicati da linee grigie e ricostituzione di FtsB e FtsL utilizzando e5-e k5-bobine sono mostrati. (B) SDS-PAGE di FtsQ50–276, FtsQ50–276/FtsB25–103 e FtsQ50–276/e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (FtsQBL) complessi. I gel SDS-PAGE sono stati visualizzati utilizzando Coomassie Blue. (C) FtsQBL heterohexamer (3 mg/mL, linea verde chiaro), FtsQBL heterotrimer (3 mg/mL, linea rossa), FtsQB (10 mg/mL, linea blu) e FtsQ (10 mg/mL, linea nera) sono stati analizzati da SEC-MALS. La linea spessa rappresenta la massa molecolare misurata. (D) Saggi BLI rappresentativi di FtsQ50–276 con FtsB25–103, FtsB61–103 e FtsB25–60. I sensorgrammi BLI con diverse concentrazioni di analiti sono indicati da diversi colori. Analisi di equilibrio e KD calcolato sono mostrati per ogni costrutti ai pannelli di destra. Gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte.

Struttura cristallina del complesso FtsQ-FtsB

Per ottenere ulteriori informazioni sull’organizzazione strutturale del complesso FtsQB, abbiamo determinato la struttura di risoluzione di 2,9 Å di FtsQ50-276 legata a FtsB25-103 (Fig. 2, Fig.supplementare. S3 e Tabella 1). La mappa della densità elettronica dei residui 25-60 non è stata osservata per FtsB25–103, mentre quasi tutte le sequenze di FtsQ50 – 276 sono state ordinate ad eccezione delle regioni flessibili N-e C-terminal (residui 50-52 e 262-276, rispettivamente; Fig. 2A e Fig. S3). Coerentemente, la mappa della densità elettronica di FtsB N-terminus (residui 22-63) non è stata osservata per FtsB nella struttura cristallina del complesso FtsQB, che è stata riportata di recente da altri gruppi26. Una possibilità per quanto riguarda la mancanza di densità elettronica è che l’elica membrana-prossimale è disordinata nel cristallo del complesso FtsQB; tuttavia, la struttura cristallina dei 30 amminoacidi juxta-membrana di FtsB ha mostrato che forma una bobina a spirale canonica27, quindi abbiamo escluso questa possibilità. Un’altra possibilità è che l’elica membrana-prossimale venga scissa automaticamente durante la purificazione e la cristallizzazione, in modo tale che il costrutto rimanente (FtsQ50–276-FtsB61–103) cristallizzi facilmente. Dato che precedenti simulazioni di dinamica molecolare del complesso FtsQBL hanno mostrato che la parte centrale di FtsB attorno al residuo di Leu60 presenta un’elica-break28, abbiamo previsto che la parte centrale di FtsB attorno a Leu60 è soggetta a proteolisi.

Figura 2

Struttura complessiva del complesso FtsQ50-276 / FtsB25-103. (A) Diagrammi a nastro stereo del complesso FtsQB. La mappa della densità elettronica dei residui 61-95 è stata osservata solo per FtsB25-103. Ogni catena è mostrata in un colore diverso. (B,C) Vista stereo ingrandita che mostra i dettagli dell’interazione all’interfaccia di FtsQ e FtsB. Ogni catena è mostrata in un colore diverso.

Tabella 1 Statistiche di raccolta e raffinamento dei dati.

La struttura complessiva di FtsQ50-276 consiste di due domini, α e β, e il dominio β è responsabile del legame FtsB25-103 (Fig. 2 BIS). La superficie accessibile al solvente sepolta all’interfaccia tra FtsQ e FtsB era di 1330 Å2, circa il 20% della superficie monomerica di FtsQ. Inoltre, circa il 50% degli atomi non idrogeni nell’interfaccia tra FtsQ e FtsB sono polari, come indicato dai calcoli della superficie di isovelocità prossimale29. La sequenza FtsB (residui 61-95) si piega in una α-elica (α3)e un β-filamento( β1; Fig. 2 BIS). Il motivo α-helix-turn-β-strand inizia con l’α-helix (residui 64-75), seguito da un ciclo attorcigliato (residui 76-82), un breve β-strand (residui 83-85) e un altro ciclo attorcigliato terminale (residui 86-95; Fig. 2C); i due anelli attorcigliati contengono due residui di prolina (Pro80 e Pro89; Fig. 2 QUATER). È interessante notare che FtsQ α5 helix adotta una forma attorcigliata incorporando Pro228 nel mezzo e questa forma sembra essere cruciale per i suoi ampi contatti con FtsB. Quando Tyr precede Pro nella sequenza aminoacidica, aumenta la tendenza del residuo Pro ad assumere una conformazione cis30; tuttavia, il residuo Pro228 di FtsQ adotta una conformazione trans (Fig. 2 QUATER).

Modalità di legame di FtsQ in complesso con FtsB

Sebbene la precedente analisi spettrometrica di massa mediante photo cross-linking indicasse che le regioni C-terminali di FtsQ e FtsB sono hotspot di interazione cruciali, le interazioni dettagliate proposte dall’analisi spettrometrica di massa erano completamente diverse da quelle osservate nella nostra struttura cristallina (Fig. 2). Sulla base dell’analisi spettrometrica di massa, è stato suggerito che il C-terminale di FtsB attorno al residuo Met77 forma un’interazione β-foglio-simile con il filamento C-terminale di FtsQ attorno al residuo Gly25523. In contrasto con questi dati, la nostra struttura cristallina ha mostrato che la regione attorno al residuo Met77 di FtsB non ha formato una struttura secondaria e la direzione della sua catena laterale è opposta alla regione di legame prevista di FtsQ (Fig. 2 QUATER). Nella nostra struttura cristallina, la regione C-terminale di FtsB (residui 61-103) interagisce estesamente con il dominio β di FtsQ e contribuisce principalmente al legame FtsQ. L’anello attorcigliato tra l’α-elica (residui 64-75) e il β-filamento (residui 83-85) avvolge il residuo Tyr248 di FtsQ (Fig. 2 TER). Per stabilizzare la conformazione del loop attorcigliato, quattro residui FtsB (Glu68, Arg72, Arg79 e Glu82) formano un cluster con ampie reti a ponte di sale (Fig. 3 BIS). FtsB Glu68 forma ponti di sale con Arg72 (2,8 Å) e Arg79 (2,8 Å), mentre Arg72 forma un ponte di sale con Glu82 (2,8 Å e 3.0 Å, rispettivamente; Fig. 3A); l’atomo Arg72 NH2 forma un’interazione aggiuntiva con l’atomo Glu68 OE2 (2.8 Å; Fig. 3 BIS). L’ammasso a ponte di sale di FtsB è cruciale nella formazione del legame idrogeno (2,7 Å) tra l’atomo di ossigeno di FtsQ Tyr248 e l’atomo di NH1 di FtsB Arg72 (Fig. 3 BIS). Inoltre, FtsB Glu69 forma un ponte di sale con FtsQ Arg196 (2.3 Å; Fig. 3 BIS). È interessante notare che il β-strand di FtsB crea un foglio β continuo con quello di FtsQ impilando anti-parallelo con β12 (Fig. 2 QUATER). FtsB Phe84 forma stretti contatti con FtsQ Tyr248, mentre Tyr85 risiede in prossimità del nucleo idrofobo del dominio β FtsQ costituito da Leu226, Leu230, Val254 e Trp256 (Fig. 2 TER). FtsB Leu87 forma anche ampi contatti con FtsQ Leu226 e la porzione alifatica di Arg222 (Fig. 2 QUATER).

Figura 3

Interazioni molecolari del complesso FtsQB in dettaglio. (A) Viste ingrandite che mostrano interazioni dettagliate alle interfacce FtsQ e FtsB. Vengono mostrati diagrammi a nastro di FtsB e diagrammi di superficie di FtsQ. Le superfici rosse indicano il 100% di residui conservati di FtsQ (Fig. S2). (B) Saggi rappresentativi BLI di FtsQ-FtsBL complesso WT e mutanti (FtsQ Y248A, FtsB E68A, FtsB E69R, FtsB R72E, e FtsB E82R). I sensorgrammi BLI con diverse concentrazioni di analiti sono indicati da diversi colori. Analisi di equilibrio e KD calcolato sono mostrati per ogni costrutti ai pannelli di destra.

Per valutare i contributi dei residui interfacciali del complesso FtsQB, i residui interfacciali conservati di FtsQ (Tyr248) e FtsB (Glu68, Glu69, Arg72 e Glu82) sono stati mutati e le loro interazioni sono state esaminate da BLI. Le affinità di legame tra FtsQ e FtsB sono state misurate immobilizzando wild-type (WT) o mutanti di GST-e5-FtsB in complesso con k5-FtsL. Come previsto, la mutazione dei residui interfacciali ha determinato una grande riduzione dell’affinità rispetto al WT (KD = 0,24 µM). Il valore KD del mutante Y248A non può essere misurato a causa di un legame debole, mentre E68A riduce l’affinità di circa 10 volte (Fig. 3 TER). Le mutazioni di inversione di carica E69R, R72E e E82R di FtsB hanno quasi abolito il legame con FtsQ (Fig. 3 TER). Ciò evidenzia il ruolo di FtsQ Tyr248 e del motivo FtsB α-helix-turn-β-strand come determinanti di affinità.

Interfaccia FtsQ e FtsB in vivo

Per verificare il legame in vitro delle regioni periplasmiche di FtsB e FtsQ, abbiamo eseguito un test batterico a due ibridi basato su una cascata di segnalazione AMP ciclica31. Poiché N-terminale della proteina Fts fusa T18 o T25 era tossico per E. coli e ha un certo grado di problema di instabilità, abbiamo costruito le proteine Fts fuse con C-terminale (T25-FtsQ, T18-FtsB)18. Il ceppo reporter di E. coli BTH101 è stato co-trasformato con una coppia di plasmidi indicati e l’efficienza di legame è stata determinata dal test della β-galattosidasi (Fig. 4 BIS). Come mostrato in Fig. 4A, WT FtsB e WT FtsQ hanno interagito tra loro. In modo simile con il test BLI, FtsB (E68A) può legarsi a WT FtsQ, mentre l’affinità di legame è stata ridotta di circa due volte rispetto a WT FtsB. Le proteine mutate ad eccezione del FtsB (E68A) hanno diminuito la loro capacità di interagire con il WT FtsQ. È coerente con i risultati di legame in vitro, indicando che i residui interfacciali di FtsQ (Y248) e FtsB (E69, R72 ed E82) svolgono un ruolo importante nella formazione del complesso FtsQB.

Figura 4

Interazioni molecolari del complesso FtsQB in vivo. (A) L’effetto delle mutazioni sui residui interfacciali di FtsQ e FtsB. Le coppie plasmidiche indicate sono state introdotte in un ceppo reporter E. coli BTH101. Le interazioni di FtsB e FtsQ sono state valutate dal sistema batterico a due ibridi. Le attività di legame sono state misurate mediante saggio β-galattosidasi e presentate come unità Miller. F, backbone plasmid; B, ftsB; Q, ftsQ; * p < 0,05, * * p < 0,005 rispetto al gruppo che esprime la proteina FtsQ fusa T18 WT e T25 fusa. (B) Confronto della stabilità tra WT e proteine mutate. E. coli MG1655 harboring plasmid pUHE21-2-lacIq codifica C-terminale His-tagged WT o proteina mutata è stato campionato nei punti di tempo indicati dopo l’aggiunta di cloramfenicolo e sottoposto al Western blotting. DnaK è stato utilizzato come controllo di carico. C) L’effetto in vivo delle mutazioni puntiformi su FtsQ e FtsB. La funzione di WT e proteine mutate è stata valutata da PNA coniugato peptide (PPNA). I ceppi di E. coli MG1655 che ospitavano i plasmidi indicati sono stati trattati con PPNA, sequenze complementari nel cromosoma di E. coli ma non nei plasmidi indicati. Le CFU sono state misurate dopo 3 ore di trattamento con PNA. Differenze significative di CFU sono indicate rispetto al gruppo di controllo che esprime WT ftsB o ftsQ. * p < 0,05, * * p < 0,005, N. S. non significativo rispetto a ftsB; # p < 0,05 rispetto a ftsQ; N. T. non trattato.

L’interazione tra FtsQ e FtsB è necessaria per il reclutamento di proteine Fts a valle. Quando FtsQ o FtsB è impoverito o introdotto con mutazione deleteria, porta alla filamentazione e alla fine alla morte delle cellule. Per valutare la funzione in vivo dei residui interfacciali FtsQB, abbiamo condotto un test di vitalità di cellule che esprimono WT o proteine mutate con acidi nucleici peptidici (PNAS). Uno studio precedente ha dimostrato che i PNAS coniugati con peptidi (PPNA) mirati ai geni essenziali avevano effetti battericidi sulle cellule di E. coli32,33,34. Il sito di legame del ribosoma è noto per essere un sito di destinazione PNA chiave per inibire la traduzione32. Poiché il legame stretto del PNA con l’mRNA interferisce con la funzione del ribosoma, viene impedita la traduzione delle proteine33. Sulla base di questi principi, abbiamo progettato quattro PPNA antisenso che sono complementari ai siti di iniziazione alla traduzione di ftsB e ftsQ (Fig. S4). La crescita del ceppo E. coli MG1655 è stata misurata per esaminare gli effetti inibitori di PPNA1 antisenso, PPNA2, PPNA3 e PPNA4. ftsB-targeting PPNA1 e ftsQ-targeting PPNA3 fortemente inibito la crescita batterica e la filamentazione di E. coli è stato osservato (Fichi supplementari S4 e S5). Quindi, abbiamo utilizzato PPNA1 e PPNA3 per ulteriori esperimenti. Abbiamo costruito plasmidi inducibili che esprimono WT FtsB, WT FtsQ, mutanti FtsB (E68A, E69R, R72E ed E82R) e mutanti FtsQ (Y248A). Poiché i PPNA utilizzati non hanno sequenze complementari ai plasmidi ricombinanti, non interferiscono con l’espressione proteica nei plasmidi. I ceppi che esprimono WT o proteine mutate non hanno mostrato differenze significative nelle unità formanti colonie (CFU) a 3 h senza PPNA. Le cellule che esprimono le proteine WT (FtsB o FtsQ) nel plasmide hanno recuperato la crescita batterica quando trattate con PPNA, ma la cellula che esprime la proteina mutata non ha recuperato la crescita tranne che per l’FtsB (E68A) (Fig. 4 QUATER). Inoltre, la filamentazione è stata osservata in batteri che esprimono proteine mutate prive della capacità di recuperare la crescita quando trattate con PPNA (Fig. S5). Per escludere la possibilità che la stabilità della proteina possa influenzare la funzione della proteina mutata, abbiamo anche determinato la stabilità della proteina in vivo bloccando la sintesi proteica de novo. Il plasmide che codifica FtsB o FtsQ fuso con il suo tag al C-terminale è stato introdotto in E. coli MG1655 e la stabilità della proteina mutata è stata confrontata con WT FtsB o FtsQ (Fig. 4B e Fig. S6). Di conseguenza, le proteine mutate ad eccezione di FtsB (E68A) hanno mostrato risultati simili a WT. Sebbene FtsB (E68A) fosse instabile rispetto a WT FtsB, questa proteina mutata FtsB (E68A) può integrare la funzione di WT FtsB e interagire con FtsQ. Presi insieme, suggerisce che le mutazioni dei residui conservati interfacciali di FtsQ (Y248) e FtsB (E69, R72 e E82) non influenzano la stabilità della proteina ma aboliscono l’interazione tra FtsB e FtsQ.

Stati oligomerici di FtsQB e FtsQBL in soluzione

In precedenza, sono stati riportati risultati contraddittori per lo stato oligomerico della proteina FtsQ. La dimerizzazione di FtsQ attraverso la sua regione transmembrana (o residui C-terminale 30) è stata osservata in un esperimento batterico a due ibridi18,35. Al contrario, un esperimento diretto per determinare lo stato oligomerico di FtsQ in soluzione è stato eseguito utilizzando l’ultracentrifugazione analitica che indica che FtsQ è un monomere19. Tuttavia, non possiamo escludere la possibilità che la regione transmembrana di FtsQ influenzi lo stato di oligomerizzazione di FtsQ, poiché l’esperimento di ultracentrifugazione analitica è stato eseguito utilizzando la regione periplasmica di FtsQ19. Anche se abbiamo anche usato le regioni periplasmiche di FtsQ, FtsQB e FtsQBL, abbiamo ipotizzato che i loro stati oligomerici in soluzione dipendano dalla concentrazione e che un’ulteriore oligomerizzazione possa verificarsi ad alte concentrazioni. Per analizzare gli stati oligomerici dipendenti dalla concentrazione di FtsQ, FtsQB o FtsQBL in soluzione, è stata eseguita una filtrazione analitica in gel utilizzando una colonna Superdex 200 (10/300 GL) e i raggi sperimentali di Stokes (RH) sono stati confrontati con quelli calcolati dai modelli di struttura (Fig. S7). I modelli di struttura di FtsQ, FtsQB e FtsQBL per il calcolo dei valori RH sono stati generati in base alla nostra struttura cristallina di FtsQB e alla struttura SAXS di FtsQBL come descritto di seguito. I segmenti invisibili dei termini N e C di FtsQ, FtsB e FtsL sono stati modellati come anelli flessibili (Fig. S7).

Per alte e basse concentrazioni di FtsQ50–276 (370 e 18,5 µM, rispettivamente), l’apparente RH (3,03 e 2,83 nm, rispettivamente) era più vicino all’RH teorico del monomero FtsQ50–276 (2,90 nm), suggerendo che FtsQ esiste principalmente come monomero in soluzione (Fig. 5). Al contrario, per il complesso FtsQB, l’apparente RH (4,33 nm) era più vicino a quello dell’eterotetramero FtsQB 2:2 (4,87 nm) ad alte concentrazioni (138 µM), mentre l’apparente RH (3,12 nm) era più vicino a quello dell’eterodimero FtsQB 1:1 (3,49 nm) a basse concentrazioni (8 µM; Fig. 5). Per supportare ulteriormente il modello di eterotetramero FtsQB 2:2, il peso molecolare di FtsQB ad alte concentrazioni (138 µM) è stato misurato mediante cromatografia ad esclusione di dimensioni con dispersione della luce multi-angolo (SECONDI). Infatti, la massa molecolare di FtsQB era coerente con un complesso 2: 2 di FtsQ e FtsB (Fig. 1C). Questi risultati suggeriscono che FtsB media la dimerizzazione di FtsQB poiché FtsQ esiste come monomero a concentrazioni alte e basse. Per il complesso FtsQBL, le forme eteroesamericane ed eterotrimeriche sono state eluite separatamente alla filtrazione del gel durante la purificazione e sono state raccolte separatamente. Ogni forma era stabile come indicato dai paragrafi (Fig. 1C), e ulteriormente utilizzato per l’analisi della filtrazione analitica del gel. Ad alte e basse concentrazioni del complesso FtsQBL (6,8–20 µM e 101-200 µM, rispettivamente), i valori RH apparenti di FTSQBL eteroesamericano erano più vicini a quelli del 2:2:2 Modello FtsQBL (5,59 nm), mentre i valori RH di FTSQBL eterotrimerico erano più vicini a quelli del modello FtsQBL 1: 1: 1 (4,28 nm) (Fig. 5). Ciò suggerisce che entrambe le forme eteroesamericane ed eterotrimeriche di FtsQBL esistono in una forma stabile indipendentemente dalle sue concentrazioni.

Figura 5

Oligomerizzazione dipendente dalla concentrazione di FtsQ50–276 / FtsB25-103. (A) Profili analitici di filtrazione in gel di FtsQ50–276 (viola), FtsQ50–276/FtsB25–103 (rosso), FtsQBL heterotrimer (verde chiaro) e FtsQBL heterohexamer (verde scuro) ad alte (101-370 µM; linee continue e asse y sinistro) e basse (6,8-20 µM; linee tratteggiate e asse y destro) concentrazioni. B) Sintesi dell’analisi idrodinamica in Fig. 5A. I valori RH della colonna sono stati confrontati con quelli calcolati dai modelli di struttura (Fig. S7) utilizzando il programma HYDROPRO.

Organizzazione strutturale del tetramero FtsQB

Successivamente abbiamo esaminato l’organizzazione strutturale dell’eterotetramero FtsQB in soluzione. Quando abbiamo valutato l’imballaggio cristallino del complesso FtsQB, un potenziale eterotetramero FtsQB è stato generato attraverso operazioni di simmetria cristallografica ed ha mostrato una struttura allungata con dimensioni complessive di 30 × 40 × 150 Å, tale che l’eterodimero FtsQB dimerizzato in modo antiparallelo testa a testa tramite i domini α-terminali N delle subunità FtsQ (Fig. S7C). Sebbene abbiamo ipotizzato che FtsQB formi un oligomero più grande tramite FtsB in base ai dati analitici di filtrazione del gel, non abbiamo potuto escludere la possibilità che l’eterotetramero FtsQB in soluzione fosse formato dalla stessa interfaccia osservata nel contatto cristallino. Quindi, abbiamo esaminato se l’interfaccia cristallografica è coinvolta nella formazione dell’eterotetramero FtsQB. All’interfaccia del dimero di FtsQ, i residui rigorosamente conservati di Leu57 e Phe87 formano un centro idrofobo all’interfaccia (Fig. supplementare. S2A); pertanto, abbiamo ipotizzato che il mutante FtsQB L57R o F87A esista come eterodimero indipendentemente dalla sua concentrazione se Leu57 e Phe87 sono residui cruciali per l’assemblaggio dell’eterotetramero FtsQB. Tuttavia, entrambi i mutanti L57R e F87A assemblati in un eterotetramero 2:2 solo ad alte concentrazioni (Fig. S8), suggerendo che l’eterotetramero FtsQB osservato in soluzione non si è formato attraverso i domini α N-terminali delle subunità FtsQ.

Abbiamo quindi ipotizzato che la regione della bobina arrotolata di FtsB sia responsabile della dimerizzazione degli eterodimeri FtsQB. In questo caso, abbiamo previsto che un mutante L46P che rompe l’elica di FtsQB inibisce la dimerizzazione degli eterodimeri FtsQB. Infatti, alcune porzioni di mutante FtsQB L46P si assemblano in eterodimeri 1:1, anche ad alte concentrazioni (Fig. S8). Questi risultati suggeriscono che la regione della bobina arrotolata di FtsB è cruciale per l’assemblaggio dell’eterotetramero FtsQB in soluzione. Nel 2:2 Modello eterotetramer FtsQB, le direzioni N-terminali di entrambe le subunità FtsB sono orientate nella stessa direzione, e quindi la regione transmembrana di FtsB può anche dimerizzare per facilitare l’omodimerizzazione di FtsB a lunghezza intera. Ciò può spiegare perché l’oligomerizzazione di ordine superiore di FtsQB è stata osservata solo ad alte concentrazioni. Coerentemente con i nostri risultati, uno studio precedente ha riferito che FtsB si auto-associa tramite bobina a spirale periplasmica e regioni transmembrane26. Per alte e basse concentrazioni di e5–FtsB25-103/k5–FtsL64-121 (191 e 22,2 µM, rispettivamente), l’apparente RH (entrambi 4.50 nm) era più vicino all’RH teorico dell’eterotetramero 2:2 di e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (4,38 nm), suggerendo che e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 esiste principalmente come eterotetramero in soluzione (Fig. S8). In accordo con questo, un recente studio che utilizza l’analisi FRET e metodi computazionali ha anche dimostrato che il complesso FtsBL forma un tetramer36.

Struttura SAXS del complesso FtsQBL

Per determinare la conformazione complessiva del complesso FtsQBL in soluzione, sono stati raccolti i dati SAXS. Il 1:1: 1 o 2: 2:2 Il complesso FtsQBL è stato utilizzato per determinare la struttura ab initio dell’involucro molecolare a basse e alte concentrazioni, rispettivamente (Fig. 6A e supplementari Fig. S9). È interessante notare che l’involucro complessivo del complesso FtsQBL 2:2:2 mostrava una forma allungata a “Y”(Fig. 6 BIS). Anche se la busta non mostrava dettagli sufficienti per posizionare i singoli domini di FtsQ, FtsB e FtsL, abbiamo osservato che la grande busta con una superficie concava si adattava ragionevolmente bene alla forma di FtsQ (Fig. 6 BIS). Per incorporare le due molecole FtsQ nel grande involucro con una superficie concava, le direzioni N-terminali di FtsQ e FtsBL dovrebbero essere opposte. Ciò era inaspettato in quanto i modelli precedenti formati da altri gruppi possedevano eliche transmembrana N-terminale orientate nella stessa direzione20. La struttura cristallina del complesso FtsQ50–276 / FtsB25-103 è stata incorporata con successo nell’involucro molecolare (Fig. 6A e supplementari Fig. S9), indicando che la conformazione complessiva del complesso FtsQ50–276-FtsB25-103 è piuttosto rigida in soluzione. L’involucro aggiuntivo è stato assegnato alle posizioni della bobina a spirale eterotetramerica e delle bobine FtsBL e5 e k5 (Fig. 6 BIS). Recentemente è stato suggerito che il sottocomplesso FtsBL sia un eterotetramero 2:2 con un’elica FtsL ininterrotta che collega la bobina a spirale transmembrana e periplasmica36; pertanto, il FtsQBL a forma di Y può adattarsi bene alla membrana curva per l’ancoraggio della membrana (Fig. 6 TER). A causa della bassa risoluzione dell’involucro SAXS, è stato difficile definire chiaramente l’assemblaggio strutturale di FtsQBL; pertanto, è necessaria un’ulteriore determinazione strutturale. Anche se abbiamo osservato 2:2 FtsQB eterotetramer e 2: 2: 2 FtsQBL eteroesamero formazione in vitro, se queste forme esistono in vivo rimane poco chiaro e ulteriori studi sono necessari per rivelare la stechiometria fisiologica del divisoma. Tuttavia, va notato che FtsQBL è stato precedentemente suggerito di formare un complesso 2: 2: 2 al divisome37. Sebbene siano necessari ulteriori studi per comprendere appieno l’organizzazione strutturale di FtsQBL nell’assemblaggio di divisomi, i nostri dati forniscono una base per ulteriori indagini.

Figura 6

Soluzione SAXS struttura di FtsQBL e modello complessivo del complesso FtsQBL. (A) Strutture di soluzione SAXS di FtsQBL 1:1:1 trimero e 2:2:2 hexamer. I modelli strutturali dei complessi FtsQBL (1:1:1 e 2: 2: 2) sono stati ricostruiti utilizzando il programma ab initio shape determination DAMMIF. Per ogni proteina, sono stati generati 10 modelli indipendenti, confrontati e un modello medio è stato calcolato utilizzando il programma DAMAVER. Il rendering superficiale dei modelli strutturali è stato ottenuto utilizzando il programma PyMOL. Per confrontare forme e dimensioni complessive, il diagramma a nastro dei modelli atomici delle proteine FtsQBL è stato sovrapposto ai modelli di atomi fittizi ricostruiti utilizzando il programma SUPCOMB. NSD = 7.039 per il modello 1:1:1 e 3.800 per il modello 2:2:2. (B)Modello complessivo di FtsQBL a forma di Y. Viene mostrata l’associazione FtsQBL reclutando il complesso FtsBL in FtsQ. Ogni catena è rappresentata in un colore diverso.

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