Strukturell Innsikt I Ftsq/FtsB/FtsL-Komplekset, En Nøkkelkomponent I Divisome

Intermolekylære interaksjoner Av FtsQ Og FtsB

Tidligere studier viste At periplasmisk subkompleks Av FtsB og FtsL kan rekonstitueres ved å erstatte membranregionene til begge proteinene med motsatt ladet, Løselig Kveilet Spoler (E5 Og K5 I Fig. 1A) 20,21,22. Ved hjelp av denne teknikken ble et stabilt binært kompleks (FtsBL) bestående Av FtsB og FtsL rekonstituert ved å uttrykke e5-FtsB25-103 og k5–FtsL64-121 i e. coli–celler (Fig . 1a Og Utfyllende Fig. S2). Det trefoldige komplekset (FtsQBL) bestående Av FtsQ, e5-FtsB og k5–FtsL ble rekonstituert ved å blande en våtcellepellet som inneholdt overuttrykt FtsQ50-276 og en cellepellet som inneholdt overuttrykt e5–FtsB25-103 og k5–FtsL64-121. FtsBL og FtsQBL komplekser ble co-eluert fra en affinitetskolonne og co-migrert på størrelse-eksklusjon kolonner (Fig. 1B, C). Stabil FtsQ50-276-FtsB25 – 103 kompleks ble dannet(Fig. 1B), men FtsQ hadde ingen bindingsaffinitet til k5-FtsL64–121 i fravær av e5-FtsB25–103 (data ikke vist), i samsvar med tidligere studie20. For å nøyaktig kartlegge bindingsområdet Mellom FtsQ og FtsB, ble to konstruksjoner (FtsB25–60 og FtsB61–103) med avkortede n – eller C-terminale regioner Av FtsB25–103 designet og deres interaksjoner Med FtsQ50–276 ble undersøkt I et bio-layer interferometry (Bli) eksperiment (Fig. 1D). FtsQ50–276 bundet Til FtsB25 – 103-komplekset med en dissosiasjonskonstant (KD) på 0,67 µ (Fig . 1D). Blant De to FtsB-konstruksjonene (FtsB25–60 og FtsB61–103) var bare FtsB61–103–binding Til FtsQ50-276 stabil (KD = 0,9 µ), noe som tyder på At C-terminalområdet For FtsB (primært rester 61-103) hovedsakelig bidrar Til FtsQ-binding (Fig. 1D), i samsvar med et tidligere resultat at C-terminus Av FtsB er nødvendig for interaksjon Med FtsQ25. Selv om en annen tidligere studie antydet at en membran-proksimal region Av FtsQ er en annen interaksjon hotspot For FtsB binding23, stabil binding Av FtsQ50 – 276 Med FtsB25-60 ble ikke observert i vårt eksperiment (Fig. 1D).

Figur 1

Kartlegging Av FtsQ-FtsB-FtsL bindende regionen. (A) Domenearkitektur Av FtsQ, FtsB og FtsL. Konstruksjoner er angitt med grå linjer og rekonstituering Av FtsB og FtsL ved hjelp av e5 – og k5-spoler er vist. (B) SDS-SIDE Av ftsq50–276, ftsq50–276/FtsB25–103, Og FtsQ50-276/e5–FtsB25-103/k5–FtsL64-121 (FtsQBL) komplekser. SDS-SIDE gels ble visualisert Ved Hjelp Av Coomassie Blå. (C) FtsQBL heterohexamer (3 mg/mL, lysegrønn linje), FtsQBL heterotrimer (3 mg/mL, rød linje), FtsQB (10 mg/mL, blå linje) og FtsQ (10 mg/mL, svart linje) ble analysert AV SEC-MALS. Den tykke linjen representerer målt molekylmasse. (D) Representative bli-analyser Av FtsQ50-276 med FtsB25–103, FtsB61-103 Og FtsB25-60. BLI sensorgram med forskjellige konsentrasjoner av analytter er indikert med forskjellige farger. Likevekts analyse og beregnet KD vises for hver konstruksjoner på høyre paneler. Forsøkene ble gjentatt tre ganger.

Krystallstruktur Av FtsQ-FtsB–komplekset

for å få ytterligere innsikt i strukturell organisering Av FtsQB–komplekset bestemte vi 2,9-Å oppløsningsstruktur For FtsQ50-276 bundet Til FtsB25-103 (Fig. 2, Supplerende Fig. S3 Og Tabell 1). Elektrontetthetskartet av rester 25-60 ble ikke observert For FtsB25–103, mens nesten alle sekvenser Av FtsQ50-276 ble funnet å bli bestilt med unntak Av n-og C-terminale fleksible regioner (rester 50-52 og 262-276, henholdsvis; Fig. 2a Og Utfyllende Fig. S3). Konsekvent ble elektrondensitetskartet Av FtsB N-terminus (rester 22-63) ikke observert For FtsB i krystallstrukturen Til FtsQB-komplekset, som nylig ble rapportert av andre gruppe26. En mulighet for mangel på elektrontetthet er at membran-proksimal helix er uordnet I krystallet Av FtsQB-komplekset; krystallstrukturen til De 30 juxta-membranaminosyrene I FtsB viste imidlertid at den danner en kanonisk spolet spole 27, og dermed utelukket vi denne muligheten. En annen mulighet er at membran-proksimal helix spaltes automatisk under rensing og krystallisering, slik at den gjenværende konstruksjonen (FtsQ50–276-FtsB61–103) krystalliserer lett. Gitt at tidligere molekylære dynamikk simuleringer Av FtsQBL komplekset viste at den sentrale delen Av FtsB rundt leu60 rest presenterer med en helix-break28, vi spådd at den sentrale delen Av FtsB rundt Leu60 er utsatt for proteolyse.

Figur 2

Samlet struktur Av ftsq50–276/FtsB25-103-komplekset. (A) Stereo bånd diagrammer Av FtsQB kompleks. Elektrondensitetskartet av rester 61-95 ble bare observert For FtsB25–103. Hver kjede er vist i en annen farge. (B,C) Forstørret stereovisning som viser detaljer om samspillet ved grensesnittet Til FtsQ og FtsB. Hver kjede er vist i en annen farge.

Tabell 1 statistikk for datainnsamling og foredling.

Den overordnede strukturen til FtsQ50–276 består av to domener, α og β, og β-domenet er ansvarlig for binding Av FtsB25–103 (Fig . 2A). Det løsemiddeltilgjengelige overflatearealet begravd ved grenseflaten Mellom FtsQ og FtsB var 1330 Å 2, omtrent 20% av Monomeroverflaten Til FtsQ. Videre er omtrent 50% av ikke-hydrogenatomer i grensesnittet mellom FtsQ og FtsB polare, som indikert ved proksimale isovelocity overflatearealberegninger29. Ftsb-sekvensen (rester 61-95) bretter seg til en α-helix (α3) og en β-strand (β 2A). Α-helix-turn-β – strandmotivet begynner med α-helix (rester 64-75), etterfulgt av en bøyd sløyfe (rester 76-82), en kort β (rester 83-85) og en annen terminal bøyd sløyfe (rester 86-95; Fig. 2C); de to knekkede løkkene inneholder to prolinrester (Pro80 Og Pro89; Fig. 2C). Interessant, FtsQ α5 helix vedtar en kinked form ved å inkorporere Pro228 i midten, og denne formen ser ut til å være avgjørende for sin omfattende kontakt med FtsB. Når Tyr går foran Pro I aminosyresekvensen, øker tendensen Til pro-resten for å ta på seg en cis-konformasjon30; Pro228-resten av FtsQ vedtar imidlertid en trans-konformasjon(Fig. 2C).

Bindingsmoduser For FtsQ i kompleks Med FtsB

selv om tidligere massespektrometrisk analyse ved fototverrbinding indikerte at C-terminale regioner Av FtsQ og FtsB er avgjørende interaksjonspunkter, var de detaljerte interaksjonene foreslått av massespektrometrisk analyse helt forskjellige fra de som ble observert i vår krystallstruktur(Fig . 2). Basert på massespektrometrisk analyse ble det foreslått At C-terminus av FtsB rundt met77-rester danner en β-arklignende interaksjon med C-terminalstrengen Av FtsQ rundt Gly255-residue23. I motsetning til disse dataene viste vår krystallstruktur at regionen Rundt Met77-rester Av FtsB ikke dannet en sekundær struktur, og retningen av sidekjeden er motsatt til det forventede bindingsområdet For FtsQ(Fig . 2C). I vår krystallstruktur interagerer Den C-terminale regionen Av FtsB (rester 61-103) i stor grad Med ftsq-domenet Og bidrar hovedsakelig Til ftsq-binding. Den knekkede sløyfen mellom α-helix (rester 64-75) og β-streng (rester 83-85)vikler rundt Tyr248-rester Av FtsQ (Fig. 2B). For å stabilisere den kinked loop konformasjon, fire FtsB rester (Glu68, Arg72, Arg79, Og Glu82) danner en klynge med omfattende salt-bro nettverk (Fig. 3A). FtsB Glu68 danner saltbroer med Både Arg72 (2,8 Å) og Arg79 (2,8 Å), Mens Arg72 danner en saltbroer Med Glu82 (2,8 Å og 3.0 Å, Henholdsvis; Fig. 3a); Arg72 NH2-atomet danner en ekstra interaksjon med Glu68 OE2-atomet (2,8 Å; Fig. 3A). Salt-bro klyngen Av FtsB er avgjørende i hydrogenbinding dannelse (2.7 Å) mellom oksygenatomet Av FtsQ Tyr248 OG NH1 atom Av FtsB Arg72(Fig. 3A). Videre danner FtsB Glu69 en saltbro med FtsQ Arg196 (2,3 Å; Fig. 3A). Interessant nok gjør β-strengen til FtsB et kontinuerlig hryvnja-ark med FtsQ ved antiparallell stabling med β12(Fig . 2C). FtsB Phe84 danner nær kontakt Med FtsQ Tyr248, Mens Tyr85 ligger i nærheten av den hydrofobe kjernen I FtsQ β-domenet som består Av Leu226, Leu230, Val254 Og Trp256(Fig. 2B). FtsB Leu87 danner også omfattende kontakter Med FtsQ Leu226 og den alifatiske delen Av Arg222 (Fig. 2C).

Figur 3

Molekylære interaksjoner Av ftsqb-komplekset i detalj. (A) Forstørrede visninger som viser detaljerte interaksjoner På ftsq og FtsB grensesnitt. Ribbon diagrammer Av FtsB og overflate diagrammer Av FtsQ er vist. Røde overflater indikerer 100% konserverte rester Av FtsQ (Supplerende Fig. S2). (B) Representative bli-analyser Av ftsq-FtsBL-kompleks WT og mutanter (FtsQ Y248A, FtsB E68A, FtsB E69R, FtsB R72E og FtsB E82R). BLI sensorgram med forskjellige konsentrasjoner av analytter er indikert med forskjellige farger. Likevekts analyse og beregnet KD vises for hver konstruksjoner på høyre paneler.

for å evaluere bidragene fra grenseflater av ftsqb-komplekset ble de grenseflater av FtsQ (Tyr248) og FtsB (Glu68, Glu69, Arg72 Og Glu82) mutert og deres interaksjoner ble undersøkt AV BLI. Bindingsaffinitetene Mellom FtsQ og FtsB ble målt ved immobilisering av villtype (WT) eller mutanter AV GST-e5-FtsB i kompleks med k5-FtsL. Som forventet resulterte mutasjon av grenseflaterester i store reduksjoner i affinitet sammenlignet med WT (KD = 0,24 µ). Kd-verdien TIL y248a-mutanten kunne ikke måles på grunn av svak binding, MENS E68A reduserte affiniteten med omtrent 10 ganger (Fig. 3B). Charge reversal mutasjoner e69r, R72E, OG E82R Av FtsB nesten avskaffet binding Til FtsQ (Fig . 3B). Dette fremhever Rollen Som ftsq Tyr248 og FtsB α-helix-turn-β-strandmotivet som affinitetsdeterminanter.

FtsQ og FtsB grensesnitt in vivo

for å verifisere in vitro binding av periplasmic regioner Av FtsB og FtsQ, utførte vi en bakteriell to-hybrid analyse basert på en syklisk AMP signalering cascade31. Da N-terminus Av T18 eller T25 smeltet Fts-protein var giftig For E. coli og har en viss grad av ustabilitetsproblem, konstruerte Vi C-terminus-smeltede fts-proteiner (T25-FtsQ, T18-FtsB)18. E. coli bth101 reporter stamme ble ko-transformert med et par indikerte plasmider og bindingseffektiviteten ble bestemt ved β-galaktosidase-analyse (Fig. 4A). Som vist I Fig. 4A, WT FtsB og WT FtsQ samhandlet med hverandre. I likhet MED bli-analysen kan FtsB (E68A) binde SEG TIL WT FtsQ, mens bindingsaffiniteten ble redusert omtrent to ganger sammenlignet med WT FtsB. De muterte proteinene unntatt FtsB (E68A) reduserte deres evne til å interagere MED WT FtsQ. Det er i samsvar med in vitro-bindende resultater, noe som indikerer at grensesnittrester Av FtsQ (Y248) Og FtsB (E69, R72 Og E82) spiller en viktig rolle i dannelsen Av ftsqb-komplekset.

Figur 4

Molekylære interaksjoner av ftsqb-komplekset in vivo. (A) effekten av mutasjoner ved grenseflaterester Av FtsQ og FtsB. De angitte plasmid-parene ble introdusert I en reporterstamme E. coli BTH101. Interaksjonene Mellom FtsB og FtsQ ble vurdert av bakteriell to-hybrid system. Bindingsaktivitetene ble målt ved β-galaktosidase-analyse og presentert som Miller-enhet. Ф, ryggradsplasmid; B, ftsB; Q, ftsQ; *p < 0,05, **p < 0,005 sammenlignet med gruppe uttrykker T18 smeltet WT FtsB og T25 smeltet FtsQ protein. (B) Sammenligning av stabiliteten MELLOM WT og muterte proteiner. E. coli MG1655 husing plasmid pUHE21-2-lacIq koding C-terminal Hans-merket WT eller mutert protein ble samplet på de angitte tidspunkter etter tilsetning av kloramfenikol og utsatt For Western blotting. DnaK ble brukt som lastekontroll. (C) in vivo-effekten av punktmutasjoner på FtsQ og FtsB. FUNKSJONEN TIL WT og muterte proteiner ble evaluert ved peptidkonjugert PNA (PPNA). E. coli mg1655 stammer som inneholdt de indikerte plasmidene ble behandlet MED ppna, komplementære sekvenser I e. coli kromosom, men ikke i de indikerte plasmidene. Cfuer ble målt etter 3 h PNA-behandling. Signifikante CFU-forskjeller er indikert sammenlignet med kontrollgruppen som uttrykker WT ftsB eller ftsQ. * p < 0,05, * * p < 0,005, N. S. ikke signifikant sammenlignet med ftsB; # p < 0,05 sammenlignet med ftsQ; N. T. ikke behandlet.

samspillet Mellom FtsQ og FtsB er nødvendig for å rekruttere Nedstrøms fts-proteiner. Når FtsQ eller FtsB er utarmet eller introdusert med skadelig mutasjon, fører det til filamentasjon og til slutt celledød. For å evaluere in vivo-funksjonen Av ftsqb-grensesnittrester, gjennomførte vi en levedyktighetsanalyse av celler som uttrykker WT eller muterte proteiner med peptidnukleinsyrer (Pna). En tidligere studie viste at peptidkonjugerte pnas (PPNAs) rettet mot essensielle gener hadde bakteriedrepende effekter på e. coli-celler32,33,34. Ribosombindingssted er kjent for å være et viktig PNA-målsted for å hemme oversettelse32. Da den tette bindingen AV PNA til mRNA forstyrrer ribosomfunksjonen, forhindres proteinoversettelse 33. Basert på disse prinsippene, vi utviklet fire antisense Ppna som er komplementære til oversettelse initiering nettsteder av ftsB og ftsQ(Supplerende Fig. S4). Veksten Av e. coli mg1655-stammen ble målt for å undersøke de hemmende effektene av antisense PPNA1, PPNA2, PPNA3 og PPNA4. ftsB-rettet MOT PPNA1 og ftsQ-rettet MOT PPNA3 sterkt hemmet bakterievekst og filamentasjon Av E. coli ble observert (Supplerende Fiken S4 og S5). Dermed benyttet VI PPNA1 og PPNA3 for videre eksperimenter. Vi konstruerte induserbare plasmider som uttrykker WT FtsB, WT FtsQ, ftsb mutanter (E68A, E69R, R72E og E82R) og FtsQ mutant (Y248A). Da De brukte Ppnaene ikke har noen komplementære sekvenser til rekombinante plasmider, forstyrrer de ikke proteinuttrykket i plasmider. Stammer som uttrykker WT eller muterte proteiner viste ingen signifikante forskjeller i kolonidannende enheter (CFU) ved 3 timer uten PPNA. Celler som uttrykte WT-proteinene (FtsB eller FtsQ) i plasmidet gjenvunnet bakterievekst når de ble behandlet med PPNA, men cellen som uttrykte det muterte proteinet gjenvunnet ikke vekst bortsett Fra FtsB (E68A) (Fig. 4C). Filamentasjonen ble også observert i bakterier som uttrykte muterte proteiner som manglet evnen til å gjenopprette vekst når de ble behandlet med PPNA (Supplerende Fig. S5). For å utelukke en mulighet for at proteinstabiliteten kan påvirke funksjonen til det muterte proteinet, bestemte vi også in vivo proteinstabilitet ved å blokkere de novo proteinsyntese. Plasmid-kodingen FtsB eller FtsQ smeltet Sammen Med hans tag på C-terminus ble introdusert I E. coli MG1655, og stabiliteten til det muterte proteinet ble sammenlignet MED WT FtsB eller FtsQ (Fig. 4B Og Utfyllende Fig. S6). Som et resultat viste de muterte proteinene unntatt FtsB (E68A) lignende resultater som WT. Selv Om FtsB (E68A) var ustabil sammenlignet MED WT FtsB, kan dette muterte proteinet FtsB (E68A) utfylle funksjonen TIL WT FtsB og samhandle med FtsQ. Til sammen antyder det at mutasjonene av grensesnittkonserverte rester Av FtsQ (Y248) og FtsB (E69, R72 og E82) ikke påvirker proteinstabiliteten, men avskaffer samspillet Mellom FtsB og FtsQ.

Oligomere tilstander Av FtsQB og FtsQBL i oppløsning

tidligere ble motstridende resultater rapportert for ftsq-proteinets oligomere tilstand. Dimerisering Av FtsQ via sin transmembrane region (eller c-terminal 30 rester) ble observert i en bakteriell to-hybrid eksperiment18, 35. I kontrast ble et direkte eksperiment for å bestemme den oligomere tilstanden Til FtsQ i oppløsning utført ved bruk av analytisk ultracentrifugering som indikerer At FtsQ er en monomer19. Vi kan imidlertid ikke utelukke muligheten for at transmembranregionen Av FtsQ påvirker oligomeriseringstilstanden Til FtsQ, siden det analytiske ultracentrifugeringsforsøket ble utført ved bruk av periplasmisk region Av FtsQ19. Selv om vi også brukte periplasmiske regioner Av FtsQ, FtsQB og FtsQBL, antydet vi at deres oligomere tilstander i oppløsning avhenger av konsentrasjonen og at ytterligere oligomerisering kan forekomme ved høye konsentrasjoner. For å analysere konsentrasjonsavhengige oligomere tilstander Av FtsQ, FtsQB eller FtsQBL i oppløsning ble analytisk gelfiltrering utført ved Bruk Av En Superdex 200 (10/300 GL) kolonne og de eksperimentelle stokes-radiene (RH) ble sammenlignet med de som ble beregnet fra strukturmodeller (Supplerende Fig. S7). Strukturmodeller Av FtsQ, FtsQB og FtsQBL for beregning AV rh-verdier ble generert basert på vår krystallstruktur Av FtsQB og SAXS struktur Av FtsQBL som beskrevet nedenfor. De usynlige segmentene Av N – og C-termini Av FtsQ, FtsB og FtsL ble modellert som fleksible løkker (Supplerende Fig. S7).

for høye og lave konsentrasjoner Av FtsQ50–276 (henholdsvis 370 og 18,5 µ) var DEN tilsynelatende RH (henholdsvis 3,03 og 2,83 nm) nærmere DEN teoretiske RH For FtsQ50–276 monomer (2,90 nm), noe som tyder på At FtsQ hovedsakelig eksisterer som en monomer i oppløsning (Fig. 5). I Motsetning til FtsQB-komplekset var den tilsynelatende RH (4,33 nm) nærmere DEN for 2:2 ftsqb heterotetramer (4,87 nm) ved høye konsentrasjoner (138 µ), mens den tilsynelatende RH (3,12 nm) var nærmere DEN for 1:1 ftsqb heterodimer (3,49 nm) ved lave konsentrasjoner (8 µ; Fig. 5). For ytterligere å støtte 2:2 ftsqb heterotetramer-modellen ble molekylvekten Til FtsQB ved høye konsentrasjoner (138 µ) målt ved størrelseskromatografi med flervinkel lysspredning (SEC-MALS). Faktisk var molekylmassen Av FtsQB i samsvar med et 2: 2 kompleks Av FtsQ og FtsB (Fig. 1C). Disse resultatene tyder på At FtsB medierer dimerisering av FtsQB siden FtsQ eksisterer som en monomer ved høye og lave konsentrasjoner. For ftsqbl-komplekset ble heteroheksamere og heterotrimere former eluert separat ved gelfiltrering under rensing og de ble samlet separat. Hver form var stabil som angitt AV SEK-MALS (Fig. 1C), og videre brukt til analyse av analytisk gelfiltrering. Ved høye og lave konsentrasjoner Av FtsQBL-komplekset (henholdsvis 6,8–20 µ og 101-200 µ) var DE tilsynelatende RH-verdiene for heteroheksamerisk FtsQBL nærmere verdiene for 2: 2:2 FtsQBL-modell (5,59 nm), MENS RH-verdiene for heterotrimerisk FtsQBL var nærmere den for 1:1: 1 FtsQBL-modellen (4,28 nm) (Fig. 5). Dette antyder at både heteroheksamere Og heterotrimere former For FtsQBL eksisterer i en stabil form uavhengig av dens konsentrasjoner.

Figur 5

Konsentrasjonsavhengig oligomerisering Av FtsQ50–276/FtsB25–103. (A) Analytiske gelfiltreringsprofiler Av FtsQ50–276 (lilla), FtsQ50–276/FtsB25–103 (rød), ftsqbl heterotrimer (lysegrønn) og ftsqbl heterohexamer (mørkegrønn) ved høye (101-370 µ; faste linjer og venstre y-akse) og lave (6,8–20 µ; stiplede linjer og høyre y-akse) konsentrasjoner. (B) Sammendrag av den hydrodynamiske analysen I Fig. 5a. RH verdier fra kolonne ble sammenlignet med de beregnet fra strukturmodeller (Supplerende Fig. S7) ved HJELP AV HYDROPRO-programmet.

Strukturell organisering av FtsQB tetramer

vi undersøkte deretter strukturell organisering Av FtsQB heterotetramer i løsning. Når vi evaluerte krystallpakking Av FtsQB-komplekset, ble en potensiell ftsqb heterotetramer generert gjennom krystallografiske symmetrioperasjoner og utstilt en langstrakt struktur med overordnede dimensjoner på 30 × 40 × 150 Å, slik At FtsQB heterodimer dimerisert på en antiparallell head-to-head-måte via N-terminale α-domener Av FtsQ-underenheter (Supplerende Fig . S7C). Selv om Vi spekulerte i At FtsQB danner en større oligomer via FtsB basert på analytiske gelfiltreringsdata, kunne vi ikke utelukke muligheten For At FtsQB heterotetramer i løsningen ble dannet av det samme grensesnittet observert i krystallkontakten. Dermed undersøkte vi om det krystallografiske grensesnittet er involvert i å danne ftsqb heterotetramer. Ved dimer-grensesnittet Til FtsQ danner strengt konserverte Leu57-og Phe87-rester en hydrofob kjerne ved grensesnittet (Supplerende Fig. (S2A); derfor hypotese vi At FtsQB L57R eller F87A mutant eksisterer som en heterodimer uavhengig av konsentrasjonen Hvis Leu57 Og Phe87 er avgjørende rester for montering Av ftsqb heterotetramer. Imidlertid samlet BÅDE L57R og F87A mutanter i en 2: 2 heterotetramer bare ved høye konsentrasjoner (Supplerende Fig. S8), noe som tyder på at den observerte FtsQB heterotetramer i oppløsning ikke ble dannet via De N-terminale α-domenene Til FtsQ-underenheter.

vi neste hypotese at den sammenrullede spolen regionen FtsB er ansvarlig for dimerization Av ftsqb heterodimerer. I dette tilfellet spådde vi at en helix-breaking L46P mutant Av FtsQB hemmer dimerization Av ftsqb heterodimerer. Faktisk samles noen deler Av FtsQB L46P mutant i 1: 1 heterodimerer, selv ved høye konsentrasjoner (Supplerende Fig. S8). Disse resultatene tyder på At den spolede spoleområdet FtsB er avgjørende for montering Av ftsqb heterotetramer i løsning. I 2:2 FtsQB heterotetramer modell, N-terminal retninger av Begge FtsB underenheter er orientert i samme retning, og dermed transmembrane regionen FtsB kan også dimerize å lette homodimerization av full-lengde FtsB. Dette kan forklare hvorfor høyere orden oligomerisering Av FtsQB ble observert bare ved høye konsentrasjoner. I samsvar med våre funn, rapporterte en tidligere studie At FtsB selvforbindelser via periplasmisk kveilet spole og transmembrane regioner26. For høye og lave konsentrasjoner av e5-FtsB25-103 / k5-FtsL64–121 (henholdsvis 191 og 22,2 µ), er DET TILSYNELATENDE RH (begge 4.50 nm) var nærmere DEN teoretiske RH av 2: 2 heterotetramer av e5-FtsB25 – 103 / k5–FtsL64-121 (4.38 nm), noe som tyder på at e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 hovedsakelig eksisterer som en heterotetramer i oppløsning (Supplerende Fig. S8). I samråd med dette viste en nylig studie ved HJELP AV FRETANALYSE og beregningsmetoder også At FtsBL-komplekset danner en tetramer36.

SAXS-struktur av FtsQBL-kompleks

FOR å bestemme den totale konformasjonen Av FtsQBL-komplekset i oppløsning ble SAXS-data samlet inn. Den 1: 1: 1 eller 2: 2:2 FtsQBL-komplekset ble brukt til å bestemme ab initio-strukturen til molekylær konvolutt ved henholdsvis lave og høye konsentrasjoner (Fig. 6A Og Utfyllende Fig. S9). Interessant nok viste Den samlede konvolutten Til ftsqbl 2:2:2-komplekset en langstrakt» Y » – form(Fig. 6A). Selv om konvolutten ikke viste tilstrekkelige detaljer for å plassere de enkelte domenene Til FtsQ, FtsB og FtsL, observerte vi at den store konvolutten med en konkav overflate passet rimelig godt med Formen På FtsQ(Fig . 6A). For å innlemme De to ftsq-molekylene i den store konvolutten med en konkav overflate, Bør De N-terminale retningene Til FtsQ og FtsBL være motsatt. Dette var uventet da de tidligere modellene dannet av andre grupper hadde N-terminale transmembrane helikser orientert i samme retning20. Krystallstrukturen Til ftsq50–276/FtsB25–103-komplekset ble vellykket innlemmet i den molekylære konvolutten(Fig. 6A Og Utfyllende Fig. S9), noe som indikerer at den totale konformasjonen Av ftsq50-276–FtsB25-103-komplekset er ganske stiv i løsningen. Den ekstra konvolutten ble tildelt posisjonene til den heterotetramere spolede spolen Og FtsBL e5-og k5-spolene (Fig. 6A). Det ble nylig foreslått At FtsBL subcomplex er en 2: 2 heterotetramer med en uavbrutt FtsL-helix som forbinder transmembran og periplasmisk spolet spole 36; derfor Kan Den Y-formede FtsQBL passe godt inn i den buede membranen for membranforankring (Fig . 6B). PÅ grunn AV DEN lave oppløsningen TIL SAXS-konvolutten var det vanskelig å klart definere den strukturelle samlingen Av FtsQBL; derfor er det nødvendig med ytterligere strukturell bestemmelse. Selv om vi observerte 2:2 FtsQB heterotetramer og 2:2:2 ftsqbl heteroheksamerdannelse in vitro, om disse formene eksisterer in vivo, forblir uklare og det kreves videre studier for å avdekke den fysiologiske støkiometrien til divisomet. Det skal imidlertid bemerkes At FtsQBL tidligere ble foreslått å danne et 2:2:2-kompleks ved divisjonen37. Selv om det er behov for flere studier for å forstå strukturell organisering Av FtsQBL i divisome assembly, gir våre data grunnlag for videre etterforskning.

Figur 6

SAXS løsningsstruktur Av FtsQBL og overordnet modell Av FtsQBL-komplekset. (A) SAXS løsningsstrukturer Av FtsQBL 1: 1: 1 trimer og 2:2:2 heksamer. Strukturelle modeller Av FtsQBL-kompleksene (1: 1:1 og 2:2: 2) ble rekonstruert ved hjelp av AB initio shape determination program DAMMIF. For hvert protein ble 10 uavhengige modeller generert, sammenlignet, og en gjennomsnittlig modell ble beregnet ved hjelp AV PROGRAMMET DAMAVER. Overflategjengivelse av strukturelle modeller ble oppnådd ved bruk av programmet PyMOL. For å sammenligne generelle former og dimensjoner ble bånddiagrammet av atommodellene Av FtsQBL-proteiner lagt på de rekonstruerte dummy-atomemodellene ved hjelp av PROGRAMMET SUPCOMB. NSD = 7,039 for 1:1:1-modellen og 3,800 for 2:2:2-modellen. (B) Samlet modell Av Y-formet FtsQBL. FtsQBL-foreningen ved å rekruttere FtsBL-komplekset Til FtsQ er vist. Hver kjede er representert i en annen farge.

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert.