Structural Insights into the Ftsq/FtsB/FtsL Complex, a Key Component of the Divisome

intermoleculaire interacties van FtsQ en FtsB

eerdere studies toonden aan dat het periplasmic subcomplex van FtsB en FtsL kan worden gereconstitueerd door de membraangebieden van beide eiwitten te vervangen door tegengesteld geladen, oplosbaar opgerolde spoelen (E5 en K5 in Fig. 1A) 20,21,22. Met behulp van deze techniek werd een stabiel binair complex (Ftsb) bestaande uit FtsB en FtsL gereconstitueerd door co-expressie van e5-FtsB25–103 en k5-FtsL64–121 in E. coli cellen (Fig. 1A en aanvullende Fig. S2). Het ternaire complex (FtsQBL) bestaande uit FtsQ, e5-FtsB en k5-FtsL werd gereconstitueerd door het mengen van een natte celpellet met overexpressieve FtsQ50–276 en een celpellet met overexpressieve e5-FtsB25–103 en k5-FtsL64–121. FtsBL en FtsQBL complexen werden co-eluted uit een affiniteit kolom en co-gemigreerd op grootte-uitsluiting kolommen (Fig. 1 TER, C). Stabiele ftsq50-276–FtsB25-103 complex werd gevormd (vijg. 1B), maar FtsQ had geen bindingsaffiniteit met k5-FtsL64–121 in afwezigheid van e5-FtsB25–103 (gegevens niet getoond), in overeenstemming met eerdere studie20. Om het bindingsgebied tussen FtsQ en FtsB precies in kaart te brengen, werden twee constructies (FtsB25–60 en FtsB61–103) met afgeknotte n – of C-terminale gebieden van FtsB25–103 ontworpen en werden hun interacties met FtsQ50–276 onderzocht in een biolaag interferometrie (BLI) experiment (Fig. 1D). FtsQ50-276 gebonden aan het FtsB25–103 complex met een dissociatieconstante (KD) van 0,67 µM (Fig. 1D). Van de twee ftsb-constructies (FtsB25-60 en FtsB61–103) was alleen FtsB61–103-binding aan FtsQ50-276 stabiel (KD = 0,9 µM), wat suggereert dat het C-eindgebied van FtsB (voornamelijk residuen 61-103) voornamelijk bijdraagt aan ftsq-binding (Fig. 1D), in overeenstemming met een eerder resultaat dat de C-terminus van FtsB noodzakelijk is voor interactie met FtsQ25. Hoewel een andere eerdere studie suggereerde dat een membraan-proximale gebied van FtsQ een andere interactie hotspot voor ftsb binding23, stabiele binding van FtsQ50-276 met FtsB25-60 werd niet waargenomen in ons experiment (Fig. 1D).

figuur 1

de ftsq-FtsB-FtsL bindingsregio in kaart brengen. (A) Domeinarchitectuur van FtsQ, FtsB en FtsL. Constructies worden aangegeven door grijze lijnen en reconstructie van FtsB en FtsL met behulp van E5 – en k5-spoelen worden weergegeven. (B) SDS-PAGE van ftsq50–276, FtsQ50–276/FtsB25–103, en FtsQ50–276/e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (FtsQBL) complexen. SDS-pagina gels werden gevisualiseerd met behulp van Coomassie Blue. (C) ftsqbl heterohexamer (3 mg/mL, lichtgroene lijn), ftsqbl heterotrimer (3 mg/mL, rode lijn), FtsQB (10 mg/mL, blauwe lijn) en FtsQ (10 mg/mL, zwarte lijn) werden geanalyseerd door SEC-MALS. De dikke lijn vertegenwoordigt gemeten molecuulmassa. D) representatieve BLI–tests van FtsQ50–276 met FtsB25–103, FtsB61–103 en FtsB25-60. BLI sensorgrams met verschillende concentraties analyten worden aangegeven door verschillende kleuren. Evenwichtsanalyse en berekende KD worden voor elke constructie op rechterpanelen getoond. De experimenten werden drie keer herhaald.

kristalstructuur van het FtsQ-FtsB-complex

om meer inzicht te krijgen in de structurele organisatie van het ftsqb-complex, bepaalden we de 2.9-Å resolutiestructuur van FtsQ50–276 gebonden aan FtsB25–103 (Fig. 2, Aanvullende Fig. S3, en Tabel 1). De elektronendichtheidskaart van residuen 25-60 werd niet waargenomen voor FtsB25-103, terwijl bijna alle sequenties van FtsQ50-276 werden gevonden om te worden geordend met uitzondering van n-en C-terminal flexibele gebieden (residuen 50-52 en 262-276, respectievelijk; Fig. 2A en aanvullende Fig. S3). Consistent werd de elektronendichtheidskaart van FtsB N-terminus (residuen 22-63)niet waargenomen voor FtsB in de kristalstructuur van FtsQB complex, die onlangs werd gerapporteerd door andere groep26. Een mogelijkheid met betrekking tot het gebrek aan elektronendichtheid is dat de membraan-proximale helix is verstoord in het kristal van FtsQB complex; echter, de kristalstructuur van de 30 juxta-membraan aminozuren van FtsB toonde aan dat het een canonieke opgerolde coil27 vormt, dus we uitgesloten deze mogelijkheid. Een andere mogelijkheid is dat de membraan-proximale helix automatisch wordt gespleten tijdens zuivering en kristallisatie, zodat de resterende constructie (FtsQ50–276-FtsB61–103) gemakkelijk kristalliseert. Aangezien eerdere moleculaire dynamicasimulaties van het ftsqbl-complex aantoonden dat het centrale deel van FtsB rond het Leu60-residu een helix-break28 vertoont, voorspelden we dat het centrale deel van FtsB rond Leu60 gevoelig is voor proteolyse.

Figuur 2

algemene structuur van het ftsq50–276/FtsB25-103 complex. (A) Stereolintdiagrammen van het FtsQB-complex. De elektronendichtheidskaart van residuen 61-95 werd alleen waargenomen voor FtsB25-103. Elke ketting wordt in een andere kleur weergegeven. (B,C) vergrote stereo weergave met details van de interactie op de interface van FtsQ en FtsB. Elke ketting wordt in een andere kleur weergegeven.

Tabel 1 statistieken betreffende gegevensverzameling en verfijning.

de algemene structuur van FtsQ50-276 bestaat uit twee domeinen, α En β, en het β-domein is verantwoordelijk voor ftsb25-103 binding (Fig. 2 bis). De oplosmiddeltoegankelijke oppervlakte die op het raakvlak tussen FtsQ en FtsB werd begraven, bedroeg 1330 Å2, ongeveer 20% van de monomeeroppervlakte van FtsQ. Bovendien zijn ongeveer 50% van de niet-waterstofatomen in het raakvlak tussen FtsQ en FtsB polair, zoals aangegeven door proximale isovelocity oppervlakteberekeningen29. De ftsb-sequentie (residuen 61-95) vouwt in één α-helix (α3) en één β-streng (β1; Fig. 2 bis). Het motief α-helix-draai-β-streng begint met de α-helix (residuen 64-75), gevolgd door een knikkring (residuen 76-82), een korte β-streng (residuen 83-85) en een andere knikkringkring (residuen 86-95; Fig. 2C); de twee geknikte lussen bevatten twee Proline residuen (Pro80 en Pro89; Fig. 2C). Interessant is dat ftsq α5 helix een knikvorm aanneemt door Pro228 in het midden op te nemen en deze vorm lijkt cruciaal te zijn voor zijn uitgebreide contacten met FtsB. Wanneer Tyr Pro in de aminozuurvolgorde voorafgaat, verhoogt het de neiging van het Pro residu om een cis-bouw aan te nemen 30; nochtans, keurt het pro228 residu van FtsQ een trans Bouw (Fig. 2C).

Bindingsmodi van FtsQ in complex met FtsB

hoewel eerdere massaspectrometrische analyse door cross-linking van foto ‘ s erop wees dat de C-terminale gebieden van FtsQ en FtsB cruciale interactiehotspots zijn, waren de gedetailleerde interacties voorgesteld door de massaspectrometrische analyse compleet verschillend van die waargenomen in onze kristalstructuur (Fig. 2). Gebaseerd op de massaspectrometrische analyse, werd gesuggereerd dat het c-Eindpunt van FtsB rond Met77 residu een β-blad-achtige interactie vormt met de C-eindstreng van FtsQ rond gly255 residue23. In tegenstelling tot deze gegevens toonde onze kristalstructuur aan dat het gebied rond Met77 residu van FtsB geen secundaire structuur vormde, en de richting van de zijketen is tegengesteld aan het verwachte bindingsgebied van FtsQ (Fig. 2C). In onze kristalstructuur interageert het C-terminale gebied van FtsB (residuen 61-103) uitgebreid met het β-domein van FtsQ en draagt het voornamelijk bij aan FtsQ binding. De geknikte lus tussen de α-helix (residuen 64-75) en de β-streng (residuen 83-85) wikkelt om het Tyr248-residu van FtsQ (Fig. 2B). Om de geknikte lusconstructie te stabiliseren, vormen vier FtsB-residuen (Glu68, Arg72, Arg79 en Glu82) een cluster met uitgebreide zoutbrugnetwerken (Fig. 3A). FtsB Glu68 vormt zoutbruggen met zowel Arg72 (2,8 Å) als Arg79 (2,8 Å), terwijl Arg72 een zoutbrug vormt met Glu82 (2,8 Å en 3).0 Å, respectievelijk; Fig. 3A); het arg72 NH2-atoom vormt een extra interactie met het glu68 OE2-atoom (2.8 Å; Fig. 3A). De zoutbrugcluster van FtsB is cruciaal voor de vorming van waterstofbinding (2,7 Å) tussen het zuurstofatoom van Ftsq Tyr248 en het NH1-atoom van FtsB Arg72 (Fig. 3A). Bovendien vormt FtsB Glu69 een zoutbrug met Ftsq Arg196 (2.3 Å; Fig. 3A). Interessant is dat de β-streng van FtsB een continue β-plaat maakt met die van FtsQ door anti-parallel stapelen met β12 (Fig. 2C). FtsB Phe84 vormt nauwe contacten met Ftsq Tyr248, terwijl Tyr85 zich in de nabijheid bevindt van de hydrofobe kern van het ftsq β-domein bestaande uit Leu226, Leu230, Val254 en Trp256 (Fig. 2B). FtsB Leu87 vormt ook uitgebreide contacten met Ftsq Leu226 en het alifatische gedeelte van Arg222 (Fig. 2C).

Figuur 3

moleculaire interacties van het ftsqb complex in detail. (A) vergrote weergaven met gedetailleerde interacties op de ftsq en FtsB interfaces. Lintdiagrammen van FtsB en oppervlaktediagrammen van FtsQ worden weergegeven. Rode oppervlakken wijzen op 100% geconserveerde residuen van FtsQ (aanvullende Fig. S2). B) representatieve BLI-tests van ftsq-FtsBL complex WT en mutanten (FtsQ Y248A, FtsB E68A, FtsB E69R, FtsB R72E en FtsB E82R). BLI sensorgrams met verschillende concentraties analyten worden aangegeven door verschillende kleuren. Evenwichtsanalyse en berekende KD worden voor elke constructie op rechterpanelen getoond.

om de bijdrage van interfaciale residuen van het ftsqb-complex te evalueren, werden de interfaciale geconserveerde residuen van FtsQ (Tyr248) en FtsB (Glu68, Glu69, Arg72 en Glu82) gemuteerd en werden hun interacties onderzocht door BLI. De binding affiniteiten tussen FtsQ en FtsB werden gemeten door het immobiliseren van wild-type (WT) of mutanten van GST-e5-FtsB in complex met k5-FtsL. Zoals verwacht resulteerde mutatie van de interfaciale residuen in grote reducties in affiniteit vergeleken met WT (KD = 0,24 µM). De KD-waarde van de y248a-mutant kon niet worden gemeten vanwege zwakke binding, terwijl E68A de affiniteit met ongeveer 10-voudig verminderde (Fig. 3B). De veranderingen E69R, R72E en E82R van ftsb van de ladingomkering schaften bijna de band aan FtsQ (Fig. 3B). Dit benadrukt de rol van Ftsq Tyr248 en het ftsb α-helix-turn-β-strand motief als affiniteitsdeterminanten.

FtsQ en FtsB interface in vivo

om de in vitro binding van de periplasmische gebieden van FtsB en FtsQ te verifiëren, hebben we een bacteriële tweehybride test uitgevoerd op basis van een cyclisch AMP signaalcascade31. Aangezien n-eindpunt van T18 of T25 gesmolten FTS-eiwit toxisch was voor E. coli en een zekere mate van instabiliteit probleem heeft, bouwden wij c-Eindpunt-gesmolten FTS-eiwitten (T25-FtsQ, T18-FtsB)18. E. coli BTH101 reporter stam werd gelijktijdig getransformeerd met een paar aangegeven plasmiden en de bindingsefficiëntie werd bepaald door β-galactosidase assay (Fig. 4A). Zoals in Fig. 4A, WT FtsB, en WT FtsQ interactie met elkaar. In gelijkaardig met de bli-analyse, kan FtsB (E68A) aan WT FtsQ binden, terwijl de bindende affiniteit ongeveer tweevoudig werd verminderd vergeleken met WT FtsB. De gemuteerde proteã nen behalve FtsB (E68A) verminderden hun capaciteit om met WT FtsQ in wisselwerking te staan. Het is consistent met de in vitro bindende resultaten, wat erop wijst dat de interfaciale residuen van FtsQ (Y248) en FtsB (E69, R72 en E82) een belangrijke rol spelen bij de vorming van het ftsqb-complex.

Figuur 4

moleculaire interacties van het ftsqb-complex in vivo. (A) het effect van mutaties op de interfaciale residuen van FtsQ en FtsB. De aangegeven plasmideparen werden ingebracht in een reporter stam E. coli BTH101. De interacties van FtsB en FtsQ werden beoordeeld door het bacteriële tweehybride systeem. De bindingsactiviteiten werden gemeten met behulp van een β-galactosidase-assay en gepresenteerd als Miller unit. Ф, backbone plasmide; B, ftsB; Q, ftsQ; * p < 0,05, * * p < 0,005 vergeleken met groep die tot expressie komt T18 gesmolten WT FtsB en T25 gesmolten FtsQ proteïne. B) vergelijking van de stabiliteit tussen WT en gemuteerde eiwitten. E. coli MG1655 met plasmide pUHE21-2-lacIq die codeert voor C-terminal His-tagged WT of gemuteerd eiwit werd op de aangegeven tijdstippen bemonsterd na toevoeging van chlooramfenicol en onderworpen aan de Western blotting. DnaK werd gebruikt als laadcontrole. C) het in vivo effect van puntmutaties op FtsQ en FtsB. De functie van gew en gemuteerde proteã nen werd geëvalueerd door peptide-geconjugeerde PNA (PPNA). E. coli MG1655 stammen met de aangegeven plasmiden werden behandeld met ppna, complementaire sequenties in E. coli chromosoom maar niet in de aangegeven plasmiden. CFU ‘ s werden gemeten na 3 uur PNA behandeling. Significante CFU-verschillen zijn aangegeven in vergelijking met de controlegroep die WT ftsB of ftsQ uitdrukt. *p < 0,05, * * p < 0,005, N. S. niet significant vergeleken met ftsB; # p < 0,05 vergeleken met ftsQ; N. T. niet behandeld.

de interactie tussen FtsQ en FtsB is vereist voor het werven van downstream FTS-eiwitten. Wanneer FtsQ of FtsB wordt uitgeput of met schadelijke verandering wordt geà ntroduceerd, leidt het tot filamentatie en uiteindelijk cellendood. Om de in vivo functie van ftsqb interfaciale residuen te evalueren, hebben we een viability assay uitgevoerd van cellen die WT of gemuteerde eiwitten uitdrukken met peptide nucleïnezuren (PNAs). Een vorige studie toonde aan dat peptide-geconjugeerde PNAS (PPNAs) gericht op essentiële genen bactericide effecten op E. coli cellen had32,33,34. De plaats van de ribosoombinding is gekend om een belangrijke doelplaats van PNA te zijn voor het remmen van translation32. Aangezien de strakke band van PNA aan mRNA met ribosoomfunctie interfereert, wordt de eiwitvertaling verhinderd 33. Op basis van deze principes hebben we vier antisense PPNAs ontworpen die complementair zijn aan de vertaalinitiatiesites van ftsB en ftsQ (aanvullende Fig. S4). De groei van de E. coli MG1655 stam werd gemeten om de remmende effecten van antisense PPNA1, PPNA2, PPNA3 en PPNA4 te onderzoeken. ftsB-targeting PPNA1 en ftsQ-targeting PPNA3 remde de bacteriegroei en filamentatie van E. coli sterk (aanvullende Fig ‘ s S4 en S5). Zo gebruikten we PPNA1 en PPNA3 voor verdere experimenten. We construeerden induceerbare plasmiden met expressie van WT FtsB, WT FtsQ, ftsb mutanten (E68A, E69R, R72E en E82R) en FtsQ mutant (Y248A). Aangezien de gebruikte PPNAs Geen aanvullende opeenvolgingen aan de recombinante plasmiden hebben, interfereren zij niet met de eiwituitdrukking in plasmiden. Stammen met expressie van WT of gemuteerde eiwitten vertoonden geen significante verschillen in kolonievormende eenheden (CFU) na 3 uur zonder PPNA. Cellen die de WT-eiwitten (FtsB of FtsQ) in het plasmide uitdrukken, herstelden bacteriegroei bij behandeling met PPNA, maar de cel die het gemuteerde eiwit uitdrukt, herstelde geen groei behalve de FtsB (E68A) (Fig. 4C). Ook, filamentatie werd waargenomen in bacteriën die gemuteerde proteã nen uitdrukken die de capaciteit ontberen om groei te herstellen wanneer behandeld met Ppna (aanvullende Fig. S5). Om een mogelijkheid uit te sluiten dat de eiwitstabiliteit de functie van het gemuteerde eiwit kan beïnvloeden, hebben we ook in vivo eiwitstabiliteit bepaald door de novo eiwitsynthese te blokkeren. De plasmide die ftsb of FtsQ codeert die met zijn tag aan het c-Eindpunt fuseerde, werd in E. coli MG1655 geà ntroduceerd, en de stabiliteit van het gemuteerde eiwit werd vergeleken met WT FtsB of FtsQ (Fig. 4B en aanvullende Fig. S6). Dientengevolge, vertoonden de gemuteerde proteã nen behalve FtsB (E68A) gelijkaardige resultaten als WT. Hoewel FtsB (E68A) onstabiel was vergeleken met WT FtsB, kan dit gemuteerde eiwit FtsB (E68A) de functie van WT FtsB aanvullen en met FtsQ interageren. Al met al suggereert het dat de mutaties van interfaciaal geconserveerde residuen van FtsQ (Y248) en FtsB (E69, R72 en E82) de eiwitstabiliteit niet beïnvloeden, maar de interactie tussen FtsB en FtsQ opheffen.

oligomere toestanden van FtsQB en FtsQBL in oplossing

eerder werden tegenstrijdige resultaten gerapporteerd voor de oligomere toestand van het ftsq-eiwit. Dimerisatie van FtsQ via zijn transmembraangebied (of C-terminale 30 residuen) werd waargenomen in een bacteriële twee-hybride proef18,35. In tegenstelling, werd een direct experiment voor het bepalen van de oligomere staat van FtsQ in oplossing uitgevoerd gebruikend analytische ultracentrifugatie die erop wijst dat FtsQ een monomer19 is. We kunnen echter niet uitsluiten dat het transmembraangebied van FtsQ de oligomerisatietoestand van FtsQ beïnvloedt, aangezien het analytische ultracentrifugatie-experiment werd uitgevoerd met behulp van het periplasmische gebied van FtsQ19. Hoewel we ook de periplasmische regio ‘ s van FtsQ, FtsQB en FtsQBL gebruikten, veronderstelden we dat hun oligomere toestanden in oplossing afhankelijk zijn van de concentratie en dat verdere oligomerisatie kan optreden bij hoge concentraties. Om de concentratie-afhankelijke oligomere toestanden van FtsQ, FtsQB of FtsQBL in oplossing te analyseren, werd analytische gelfiltratie uitgevoerd met behulp van een superdex 200 (10/300 GL) kolom en werden de experimentele stokesradii (RH) vergeleken met die berekend uit structuurmodellen (aanvullende Fig. S7). Structuurmodellen van FtsQ, FtsQB en FtsQBL voor het berekenen van RH-waarden werden gegenereerd op basis van onze kristalstructuur van FtsQB en SAXS-structuur van FtsQBL zoals hieronder beschreven. De onzichtbare segmenten van de N-en C-termini van FtsQ, FtsB en FtsL werden gemodelleerd als flexibele lussen (aanvullende Fig. S7).

voor hoge en lage concentraties van FtsQ50–276 (respectievelijk 370 en 18,5 µM) lag de schijnbare relatieve vochtigheid (respectievelijk 3,03 en 2,83 nm) dichter bij de theoretische relatieve vochtigheid van ftsq50–276-monomeer (2,90 nm), wat erop wijst dat FtsQ voornamelijk bestaat als monomeer in oplossing (Fig. 5). In tegenstelling, voor de FtsQB complex, de schijnbare RH (4.33 nm) was dichter bij dat van de 2:2 FtsQB heterotetramer (4.87 nm) bij hoge concentraties (138 µM), terwijl de schijnbare RH (3.12 nm) was dichter bij die van de 1:1 FtsQB heterodimer (3.49 nm) bij lage concentraties (8 µM; Fig. 5). Om het 2:2 ftsqb heterotetramer model verder te ondersteunen, werd het molecuulgewicht van FtsQB bij hoge concentraties (138 µM) gemeten door middel van size-exclusion chromatografie met multi-angle light scattering (SEC-MALS). De molecuulmassa van FtsQB kwam inderdaad overeen met een 2:2 complex van FtsQ en FtsB (Fig. 1C). Deze resultaten suggereren dat FtsB dimerisatie van FtsQB bemiddelt omdat FtsQ als monomeer in hoge en lage concentraties bestaat. Voor het FtsQBL-complex werden heterohexamerische en heterotrimere vormen afzonderlijk geëlueerd bij de gelfiltratie tijdens de zuivering en werden ze afzonderlijk verzameld. Elke vorm was stabiel zoals aangegeven door SEC-MALS (Fig. 1C), en verder gebruikt voor de analyse van analytische gelfiltratie. Bij hoge en lage concentraties van het FtsQBL-complex (respectievelijk 6,8–20 µM en 101-200 µM) lagen de schijnbare relatieve vochtigheid van heterohexamerische FtsQBL dichter bij die van de 2: 2:2 FtsQBL-model (5,59 nm), terwijl de RH-waarden van heterotrimere FtsQBL dichter bij die van het 1:1:1 FtsQBL-model (4,28 nm) lagen (Fig. 5). Dit suggereert dat zowel heterohexamerische als heterotrimere vormen van FtsQBL in een stabiele vorm bestaan, ongeacht de concentraties ervan.

Figuur 5

concentratie-afhankelijke oligomerisatie van FtsQ50-276 / FtsB25-103. A) analytische gelfiltratieprofielen van FtsQ50–276 (paars), FtsQ50–276/FtsB25–103 (rood), ftsqbl heterotrimer (lichtgroen) en ftsqbl heterohexamer (donkergroen) bij hoge concentraties (101-370 µM; vaste lijnen en linker y-as) en lage concentraties (6,8–20 µM; stippellijnen en rechter y-as). B) samenvatting van de hydrodynamische analyse in Fig. 5A. RH-waarden uit kolom werden vergeleken met die berekend op basis van structuurmodellen (aanvullende Fig. S7) met behulp van HYDROPRO programma.

structurele organisatie van het ftsqb-tetrameer

vervolgens hebben we de structurele organisatie van het ftsqb-heterotetrameer in oplossing onderzocht. Wanneer we geëvalueerd in crystal verpakking van de FtsQB complex, een potentiële FtsQB heterotetramer werd gegenereerd door kristallografische symmetrie-operaties en exposeerde een langgerekte structuur met een totale afmeting van 30 × 40 × 150 Å, zodanig dat de FtsQB heterodimer dimerized in een antiparallel head-to-head mode via de N-terminale α-domeinen van FtsQ subeenheden (Aanvullende Fig. S7C). Hoewel we speculeerden dat FtsQB een grotere oligomeer vormt via FtsB op basis van analytische gelfiltratiegegevens, konden we de mogelijkheid niet uitsluiten dat de ftsqb heterotetramer in oplossing werd gevormd door dezelfde interface die werd waargenomen in het kristalcontact. Zo hebben we onderzocht of de kristallografische interface betrokken is bij het vormen van de ftsqb heterotetramer. Bij de dimeer-interface van FtsQ vormen strikt geconserveerde Leu57-en Phe87-residuen een hydrofobe kern op de interface (aanvullende Fig. S2A); daarom werd verondersteld dat de ftsqb l57r of F87A mutant als heterodimer bestaat, ongeacht de concentratie ervan, als Leu57 en Phe87 cruciale residuen zijn voor de assemblage van de ftsqb heterotetramer. Echter, zowel l57r als F87A mutanten samengevoegd tot een 2: 2 heterotetramer alleen in hoge concentraties (aanvullende Fig. S8), wat suggereert dat het waargenomen ftsqb heterotetramer in oplossing niet werd gevormd via de N-terminale α-domeinen van FtsQ-subeenheden.

we stelden vervolgens de hypothese op dat de coiled coil regio van FtsB verantwoordelijk is voor de dimerisatie van ftsqb heterodimers. In dit geval voorspelden we dat een helix-brekende l46p-mutant van FtsQB dimerisatie van ftsqb-heterodimers remt. Sommige delen van de ftsqb l46p-mutant vormen zelfs bij hoge concentraties 1: 1 heterodimers (aanvullende Fig. S8). Deze resultaten suggereren dat het opgerolde spoelgebied van FtsB cruciaal is voor de assemblage van de ftsqb heterotetramer in oplossing. In de 2:2 ftsqb heterotetramer model, de N-terminal richtingen van beide ftsb subeenheden zijn georiënteerd in dezelfde richting, en dus kan het transmembraangebied van FtsB ook dimeriseren om homodimerisatie van full-length FtsB te vergemakkelijken. Dit kan verklaren waarom hogere-orde oligomerisatie van FtsQB alleen bij hoge concentraties werd waargenomen. In overeenstemming met onze bevindingen rapporteerde een vorige studie dat FtsB zichzelf associeert via periplasmische opgerolde spoel en transmembrane regio ‘ S26. Voor hoge en lage concentraties van e5-FtsB25-103/k5–FtsL64-121 (respectievelijk 191 en 22,2 µM), de schijnbare relatieve vochtigheid (beide 4.50 nm) lag dichter bij de theoretische relatieve vochtigheid van het 2: 2 heterotetrameer van e5-FtsB25–103 / k5-FtsL64-121( 4.38 nm), wat suggereert dat E5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 voornamelijk bestaat als heterotetrameer in oplossing (aanvullende Fig. S8). In overeenstemming met dit, een recente studie met behulp van FRET analyse en computationele methoden toonde ook aan dat de ftsbl complex vormt een tetramer36.

saxs structure of FtsQBL complex

om de algehele conformatie van het ftsqbl complex in oplossing te bepalen, werden SAXS-gegevens verzameld. De 1: 1: 1 of 2: 2:2 FtsQBL complex werd gebruikt om de ab initio structuur van de moleculaire envelop te bepalen bij lage en hoge concentraties, respectievelijk (Fig. 6A en aanvullende Fig. S9). Interessant is dat het totale omhulsel van het ftsqbl 2:2:2-complex een langgerekte “Y” – vorm vertoonde (Fig. 6 bis). Hoewel de envelop niet voldoende details vertoonde om de afzonderlijke domeinen van FtsQ, FtsB en FtsL te positioneren, merkten we op dat de grote envelop met een concaaf oppervlak redelijk goed paste bij de vorm van FtsQ (Fig. 6 bis). Om de twee ftsq-moleculen op te nemen in de grote envelop met een concaaf oppervlak, moeten de N-terminale richtingen van FtsQ en FtsBL tegenovergesteld zijn. Dit was onverwacht omdat de vorige modellen, gevormd door andere groepen, n-terminale transmembraanschroeven bezaten die in dezelfde richting georiënteerd waren20. De kristalstructuur van het ftsq50–276/FtsB25-103 complex werd met succes opgenomen in de moleculaire envelop (Fig. 6A en aanvullende Fig. S9), wat aangeeft dat de totale bouw van het ftsq50–276-FtsB25–103 complex vrij star in oplossing is. De extra envelop werd toegewezen aan de posities van de heterotetramere opgerolde spoel en FtsBL e5-en k5-spoelen (Fig. 6 bis). Onlangs werd gesuggereerd dat het FtsBL subcomplex een 2: 2 heterotetramer is met een ononderbroken ftsl-helix die de transmembrane en periplasmische opgerolde coil36 verbindt; daarom kan de Y-vormige FtsQBL goed passen in het gebogen membraan voor membraanankering (Fig. 6B). Vanwege de lage resolutie van de saxs-envelop was het moeilijk om de structurele assemblage van FtsQBL duidelijk te definiëren; daarom is verdere structurele bepaling vereist. Hoewel we waargenomen 2:2 ftsqb heterotetrameer en 2:2:2 ftsqbl heterohexameervorming in vitro, of deze vormen in vivo bestaan, blijft onduidelijk en verdere studies zijn nodig om de fysiologische stoichiometrie van het delioom aan het licht te brengen. Er moet echter worden opgemerkt dat FtsQBL eerder werd voorgesteld om een 2:2:2 complex te vormen in de divisome37. Hoewel aanvullende studies nodig zijn om de structurele organisatie van FtsQBL in divisome assembly volledig te begrijpen, bieden onze gegevens een basis voor verder onderzoek.

Figuur 6

SAXS solution structure of FtsQBL and overall model of the FtsQBL complex. (A) Sax-oplossingsstructuren van FtsQBL 1:1:1 trimer en 2:2:2 hexameer. Structurele modellen van de ftsqbl complexen (1:1:1 en 2:2: 2) werden gereconstrueerd met behulp van het AB initio shape determination program DAMMIF. Voor elk eiwit werden 10 onafhankelijke modellen gegenereerd, vergeleken, en een gemiddeld model werd berekend met behulp van het programma DAMAVER. Oppervlakteweergave van de structurele modellen werd bereikt met behulp van het programma PyMOL. Om de algemene vormen en afmetingen te vergelijken, werd het lintdiagram van de atomaire modellen van ftsqbl-eiwitten met behulp van het programma SUPCOMB op de gereconstrueerde atomaire modellen gesuperponeerd. NSD = 7.039 voor het 1:1:1 model en 3.800 voor het 2:2: 2 model. B) algemeen model van Y-vormige FtsQBL. De ftsqbl vereniging door het werven van de FtsBL complex om FtsQ wordt getoond. Elke ketting wordt weergegeven in een andere kleur.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.