wgląd strukturalny w kompleks Ftsq | Ftsb/FtsL, kluczowy składnik dzielnika

interakcje międzycząsteczkowe ftsq i FtsB

poprzednie badania wykazały, że subkompleks peryplazmatyczny FtsB i FtsL można odtworzyć przez zastąpienie regionów błonowych obu białek z przeciwstawnie naładowanymi, rozpuszczalnymi zwojami (E5 i K5 na fig. 1A) 20,21,22. Stosując tę technikę, stabilny kompleks binarny (ftsbl) składający się z FtsB i FtsL odtworzono przez współekspresję e5-FtsB25-103 i k5–FtsL64-121 w komórkach E. coli (Fig. 1a i dodatkowe rys. S2). Kompleks trójskładnikowy (FtsQBL) składający się z FtsQ, e5-FtsB i k5-ftsl odtworzono przez zmieszanie mokrego granulatu komórkowego zawierającego nadekspresję ftsq50–276 i granulatu komórkowego zawierającego nadekspresję e5-FtsB25–103 i k5-FtsL64–121. Kompleksy ftsbl i ftsqbl były współeluowane z kolumny powinowactwa i współmigrowane na kolumnach wykluczających rozmiar (Fig. 1B, C). Stabilny ftsq50-276-ftsb25-103 kompleks został utworzony (rys. 1B), ale FtsQ nie wykazuje powinowactwa wiązania z k5–FtsL64-121 przy braku e5–FtsB25-103 (dane nie zostały przedstawione), zgodnie z poprzednim badanią20. Aby precyzyjnie odwzorować region wiązania między FtsQ i FtsB, zaprojektowano dwa konstrukty (FtsB25–60 i FtsB61 – 103) ze skróconymi regionami końcowymi N lub C ftsb25-103 i zbadano ich interakcje z ftsq50–276 w eksperymencie interferometrii biowarstwowej (bli) (Fig. 1D). FtsQ50–276 związany z kompleksem FtsB25-103 o stałej dysocjacji (KD) 0,67 µM (Fig. 1D). Wśród dwóch konstrukcji ftsb (FtsB25–60 i FtsB61–103) tylko Wiązanie ftsb61–103 z FtsQ50-276 było stabilne (KD = 0,9 µM), co sugeruje, że region C-końcowy FtsB (głównie pozostałości 61-103) głównie przyczynia się do wiązania FtsQ (Fig. 1D), zgodnie z poprzednim wynikiem, że C-koniec ftsb jest niezbędny do interakcji z FtsQ25. Chociaż inne poprzednie badania sugerowały, że obszar błona-proksymalny ftsq jest kolejnym punktem zwrotnym interakcji dla wiązania ftsb23, stabilne Wiązanie FtsQ50–276 z FtsB25–60 nie zaobserwowano w naszym eksperymencie (Fig. 1D).

Rysunek 1

mapowanie regionu wiążącego FtsQ-FtsB-FtsL. (A) architektura domeny ftsq, FtsB i FtsL. Konstrukcje są oznaczone szarymi liniami, a odtworzenie ftsb i ftsl za pomocą cewek e5 i K5 jest pokazane. B) SDS–PAGE kompleksów ftsq50–276, ftsq50–276/FtsB25–103 i ftsq50-276/e5–ftsb25-103/k5–ftsl64-121 (FtsQBL). Żele SDS-PAGE zostały wizualizowane za pomocą Coomassie Blue. C) heteroheksamer FtsQBL (3 mg/mL, linia jasnozielona), heterotrimer ftsqbl (3 mg/mL, linia czerwona), FtsQB (10 mg/mL, linia niebieska) i ftsq (10 mg/mL, linia Czarna) analizowano za pomocą SEC-MALS. Gruba linia reprezentuje zmierzoną masę cząsteczkową. D) reprezentatywne testy BLI ftsq50–276 z FtsB25–103, FtsB61–103 i FtsB25-60. Bli sensorgramy o różnych stężeniach analitów są oznaczone różnymi kolorami. Analiza równowagi i obliczone KD są pokazane dla każdego konstruktu na odpowiednich panelach. Eksperymenty powtórzono trzy razy.

struktura krystaliczna kompleksu ftsq-ftsb

aby uzyskać dalsze wgląd w organizację strukturalną kompleksu ftsqb, ustaliliśmy strukturę rozdzielczości 2,9–Å ftsq50–276 związaną z FtsB25-103 (rys. 2, Dodatkowe Rys. S3 I Tabela 1). Mapa gęstości elektronów reszt 25-60 nie była obserwowana dla FtsB25–103, podczas gdy prawie wszystkie sekwencje FtsQ50–276 okazały się być uporządkowane z wyjątkiem N – I C-końcowych regionów elastycznych (odpowiednio reszt 50-52 i 262-276; Fig. 2a i dodatkowe rys. S3). Konsekwentnie, Mapa gęstości elektronów N-końca ftsb (reszt 22-63) nie była obserwowana dla ftsb w strukturze krystalicznej kompleksu FtsQB, co zostało niedawno zgłoszone przez inną grupę26. Jedną z możliwości w odniesieniu do braku gęstości elektronów jest to, że helisa błona-proksymalna jest nieuporządkowana w krysztale kompleksu FtsQB; jednak struktura krystaliczna 30 juxta-membrana aminokwasów ftsb wykazała, że tworzy ona kanonicznie zwinięty zwoj27, dlatego wykluczyliśmy tę możliwość. Inną możliwością jest automatyczne rozszczepianie helisy błona-proksymalna podczas oczyszczania i krystalizacji, tak że pozostała konstrukcja (FtsQ50–276-FtsB61–103) łatwo się krystalizuje. Biorąc pod uwagę, że poprzednie symulacje dynamiki molekularnej kompleksu ftsqbl wykazały, że centralna część FtsB wokół pozostałości Leu60 zawiera helisę-break28, przewidzieliśmy, że centralna część ftsb wokół Leu60 jest podatna na proteolizę.

Rysunek 2

ogólna struktura kompleksu FtsQ50–276/FtsB25–103. A) Stereofoniczne Schematy wstęgowe kompleksu FtsQB. Mapa gęstości elektronów reszt 61-95 była obserwowana tylko dla FtsB25-103. Każdy łańcuch jest pokazany w innym kolorze. (B,C) powiększony widok stereo pokazujący szczegóły interakcji na interfejsie FtsQ i FtsB. Każdy łańcuch jest pokazany w innym kolorze.

Tabela 1 statystyki dotyczące gromadzenia i udoskonalania danych.

ogólna struktura FtsQ50-276 składa się z dwóch domen, α i β, a domena β jest odpowiedzialna za Wiązanie FtsB25–103 (Fig. 2A). Powierzchnia dostępna dla rozpuszczalników zakopana na styku FtsQ i FtsB wynosiła 1330 Å2, czyli około 20% powierzchni monomeru ftsq. Co więcej, około 50% atomów niewodu w styku między FtsQ i FtsB jest polarnych, na co wskazują obliczenia powierzchni bliższej izowłókniości29. Sekwencja FtsB (pozostałości 61-95) składa się w jedną helisę α (α3) i jedną nitkę β (β1; Fig. 2A). Motyw α-helisy-zwoju-nici β zaczyna się od α-helisy (reszt 64-75), po której następuje załamana pętla (reszt 76-82), krótka nitka β (reszt 83-85) i kolejna końcowa załamana pętla (reszt 86-95; Fig. 2C); dwie zwinięte pętle zawierają dwie pozostałości proliny (Pro80 i Pro89; rys. 2C). Co ciekawe, helisa ftsq α5 przyjmuje kształt załamany przez włączenie Pro228 w środku i kształt ten wydaje się być kluczowy dla jego rozległych kontaktów z FtsB. Kiedy Tyr wyprzedza Pro w sekwencji aminokwasowej, zwiększa tendencję reszty Pro do przyjmowania konformacji cis30; jednak pozostałość Pro228 ftsq przyjmuje konformację trans(rys. 2C).

tryby wiązania FtsQ w kompleksie z FtsB

chociaż poprzednia analiza spektrometryczna mas za pomocą fotosieciowania wykazała, że C-końcowe regiony ftsq i FtsB są kluczowymi punktami aktywnymi interakcji, szczegółowe interakcje zaproponowane przez Analizę spektrometryczną masy były całkowicie różne od tych obserwowanych w naszej strukturze krystalicznej (Fig. 2). W oparciu o analizę spektrometryczną masy zasugerowano, że C-koniec ftsb wokół pozostałości Met77 tworzy interakcję podobną do arkusza β z C-końcową nicią FtsQ wokół pozostałości Gly25523. W przeciwieństwie do tych danych, Nasza struktura krystaliczna wykazała, że region wokół pozostałości Met77 FtsB nie tworzy struktury wtórnej, a kierunek jej łańcucha bocznego jest przeciwny do oczekiwanego regionu wiązania ftsq (Fig. 2C). W naszej strukturze krystalicznej region C-końcowy ftsb (pozostałości 61-103) w znacznym stopniu oddziałuje z domeną β ftsq i głównie przyczynia się do wiązania FtsQ. Załamana pętla między α-helisą (pozostałości 64-75) i β-nicią (pozostałości 83-85) otacza pozostałość Tyr248 ftsq (Fig. 2b). Aby ustabilizować konformację zakrzywionej pętli, cztery pozostałości FtsB (Glu68, Arg72, Arg79 i Glu82) tworzą klaster z rozległymi sieciami mostków solnych (rys. 3A). FtsB Glu68 tworzy mosty solne z Arg72 (2,8 Å) i Arg79 (2,8 Å), podczas gdy Arg72 tworzy most solny z Glu82 (2,8 Å i 3.0 Å, odpowiednio; rys. 3A); atom Arg72 NH2 tworzy dodatkową interakcję z atomem Glu68 OE2 (2.8 Å; Fig. 3A). Klaster mostków solnych ftsb ma kluczowe znaczenie w tworzeniu wiązania wodorowego (2,7 Å) między atomem tlenu Ftsq Tyr248 a atomem NH1 Ftsb Arg72 (Fig. 3A). Ponadto Ftsb Glu69 tworzy mostek solny z FtsQ Arg196 (2.3 Å; rys. 3A). Co ciekawe, łańcuch β ftsb tworzy ciągły arkusz β z arkuszem FtsQ przez anty-równoległe układanie z β12(Fig. 2C). FtsB Phe84 tworzy bliskie kontakty z Ftsq Tyr248, podczas gdy Tyr85 znajduje się w bliskim sąsiedztwie hydrofobowego rdzenia domeny β ftsq składającej się z Leu226, Leu230, Val254 i Trp256 (Fig. 2b). FtsB Leu87 tworzy również rozległe kontakty z Ftsq Leu226 i alifatyczną częścią Arg222 (rys. 2C).

Rysunek 3

interakcje molekularne kompleksu FtsQB w szczegółach. (A) powiększone widoki pokazujące szczegółowe interakcje na interfejsach FtsQ i ftsb. Pokazano Schematy wstęgowe FtsB i powierzchniowe ftsq. Czerwone powierzchnie wskazują na 100% zachowane pozostałości FtsQ (dodatkowe rys. S2). B) reprezentatywne testy BLI kompleksu ftsq-FtsBL WT i mutantów (FtsQ Y248A, FTSB E68A, FTSB E69R, FTSB R72E i ftsb E82R). Bli sensorgramy o różnych stężeniach analitów są oznaczone różnymi kolorami. Analiza równowagi i obliczone KD są pokazane dla każdego konstruktu na odpowiednich panelach.

w celu oceny udziału międzyfazowych reszt kompleksu ftsqb zmutowano międzyfazowe konserwowane reszty ftsq (Tyr248) i Ftsb (Glu68, Glu69, Arg72 i Glu82) i zbadano ich interakcje za pomocą BLI. Powinowactwo wiązania między FtsQ i FtsB mierzono przez unieruchomienie typu dzikiego (WT) lub mutantów GST-e5-ftsb w kompleksie z k5-FtsL. Zgodnie z oczekiwaniami, mutacja reszt międzyfazowych powodowała znaczne zmniejszenie powinowactwa w porównaniu z WT(KD = 0,24 µM). Wartość KD mutanta Y248A nie mogła zostać zmierzona z powodu słabego wiązania, podczas gdy e68a zmniejszyło powinowactwo około 10-krotnie (Fig. 3b). Mutacje odwrócenia ładunku e69r, R72E i E82R ftsb prawie zniosły wiązanie z FtsQ (Fig. 3b). Podkreśla to rolę Ftsq Tyr248 i motywu ftsb α-helix-turn-β-strand jako determinantów powinowactwa.

interfejs FtsQ i ftsb in vivo

aby zweryfikować Wiązanie in vitro regionów peryplazmicznych ftsb i FtsQ, wykonaliśmy test dwóch hybryd bakteryjnych oparty na cyklicznej kaskadzie sygnałowej AMP31. Ponieważ N-KONIEC skondensowanego białka FTS T18 lub T25 był toksyczny dla E. coli i ma pewien problem niestabilności, skonstruowaliśmy białka skondensowane FTS (T25-FtsQ, T18-FtsB)18. Szczep reporterowy bth101 E. coli współwystępował z parą wskazanych plazmidów, a skuteczność wiązania oznaczono metodą β-galaktozydazy (Fig. 4a). Jak pokazano na Fig. 4a, WT FtsB i WT FtsQ współdziałały ze sobą. Podobnie jak w teście BLI, FtsB (E68A) może wiązać się z WT FtsQ, podczas gdy powinowactwo wiązania było zmniejszone około dwukrotnie w porównaniu z WT FTSB. Zmutowane białka z wyjątkiem FtsB (E68A) zmniejszały ich zdolność do interakcji z WT FtsQ. Jest to zgodne z wynikami wiązania in vitro, co wskazuje, że międzyfazowe pozostałości ftsq (Y248) i FtsB (E69, R72 i E82) odgrywają ważną rolę w tworzeniu kompleksu FtsQB.

Rysunek 4

interakcje molekularne kompleksu ftsqb in vivo. A) wpływ mutacji na międzyfazowe pozostałości ftsq i FtsB. Wskazane pary plazmidów wprowadzono do reporterowego szczepu E. coli bth101. Interakcje ftsb i FtsQ oceniano za pomocą bakteryjnego układu dwu-hybrydowego. Aktywność wiązania mierzono metodą β-galaktozydazy i przedstawiono jako jednostkę Millera. Ф, plazmid szkieletowy; B, ftsB; Q, ftsQ; *p < 0,05, * * p < 0,005 w porównaniu z grupą wyrażającą T18 skondensowane WT ftsb i T25 skondensowane białko FtsQ. B) porównanie stabilności między WT i zmutowanymi białkami. E. coli MG1655 zawierające plazmid pUHE21-2-lacIq kodujący C-końcowy znakowany przez His WT lub zmutowane białko pobrano we wskazanych punktach czasowych po dodaniu chloramfenikolu i poddano Western blotting. DnaK był używany jako kontrola załadunku. C) wpływ mutacji punktowych in vivo na FtsQ i FtsB. Funkcję WT i zmutowanych białek oceniano za pomocą sprzężonego z peptydem pna (PPNA). Szczepy MG1655 E. coli zawierające wskazane plazmidy leczono PPNA, komplementarnymi sekwencjami w chromosomie E. coli, ale nie we wskazanych plazmidach. CFU mierzono po 3 godzinach leczenia PNA. Wskazano istotne różnice CFU w porównaniu z grupą kontrolną wyrażającą WT ftsB lub ftsQ. *p < 0, 05, * * P < 0, 005, N. S. nieistotne w porównaniu z ftsB; # p < 0, 05 w porównaniu z ftsQ; N. T. nie leczone.

interakcja między ftsq i FtsB jest wymagana do rekrutacji kolejnych białek Fts. Kiedy ftsq lub FtsB jest zubożony lub wprowadzony z szkodliwą mutacją, prowadzi to do filamentacji i ostatecznie śmierci komórek. Aby ocenić funkcję in vivo reszt międzyfazowych FtsQB, przeprowadziliśmy test żywotności komórek wyrażających WT lub zmutowane białka z peptydowymi kwasami nukleinowymi (PNAs). Poprzednie badanie wykazało,że skoniugowane peptydowo PNAs (Ppna) ukierunkowane na istotne geny miały działanie bakteriobójcze na komórki E. coli32,33, 34. Wiadomo, że miejsce wiązania rybosomów jest kluczowym miejscem docelowym PNA w hamowaniu translacji32. Ponieważ ścisłe wiązanie PNA z mRNA zakłóca działanie rybosomu, zapobiega się translacji białkowej33. W oparciu o te zasady zaprojektowaliśmy cztery antysensowne Ppna, które są komplementarne do miejsc inicjacji translacji ftsb i ftsQ (dodatkowe rys. S4). Wzrost szczepu E. coli MG1655 mierzono w celu zbadania hamującego działania antysensownych PPNA1, PPNA2, PPNA3 i PPNA4. FTSB-ukierunkowane na PPNA1 i ftsq-ukierunkowane na PPNA3 obserwowano silnie hamujący wzrost bakterii i filamentację E. coli (uzupełniające Fig S4 i S5). W ten sposób wykorzystaliśmy PPNA1 i PPNA3 do dalszych eksperymentów. Skonstruowaliśmy indukowalne plazmidy wyrażające WT ftsb, WT ftsq, mutanty ftsb (E68A, E69R, R72E i E82R) i mutanty ftsq (Y248A). Ponieważ użyte Ppna nie mają komplementarnych sekwencji do rekombinowanych plazmidów, nie zakłócają one ekspresji białka w plazmidach. Szczepy wykazujące ekspresję WT lub zmutowanych białek nie wykazywały znaczących różnic w jednostkach tworzących kolonie (CFU) po 3 h bez PPNA. Komórki wyrażające białka WT (FtsB lub FtsQ) w plazmidzie odzyskiwały wzrost bakterii po potraktowaniu PPNA, ale komórka wyrażająca zmutowane białko nie odzyskiwała wzrostu, z wyjątkiem FtsB (E68A) (Fig. 4C). Zaobserwowano również filamentację u bakterii ekspresji zmutowanych białek pozbawionych zdolności do odzyskiwania wzrostu po leczeniu PPNA(Fig. S5). Aby wykluczyć możliwość, że stabilność białka może wpływać na funkcję zmutowanego białka, oznaczono również stabilność białka in vivo, blokując syntezę białek de novo. Plazmid kodujący FtsB lub FtsQ połączony z jego znacznikiem na końcu C został wprowadzony do E. coli MG1655, a stabilność zmutowanego białka porównano z WT FTSB lub FtsQ (Fig. 4B i dodatkowe rys. S6). W rezultacie zmutowane białka z wyjątkiem ftsb (E68A) wykazały podobne wyniki jak WT. Chociaż ftsb (E68A) był niestabilny w porównaniu z WT FTSB, to zmutowane białko FtsB (E68A) może uzupełniać funkcję WT FTSB i wchodzić w interakcje z FtsQ. Łącznie sugeruje, że mutacje międzyfazowych konserwowanych reszt FtsQ (Y248) i FtsB (E69, R72 i E82) nie wpływają na stabilność białka, ale znoszą interakcję między FtsB i FtsQ.

Stany oligomeryczne ftsqb i FtsQBL w roztworze

wcześniej zgłaszano sprzeczne wyniki dla stanu oligomerycznego białka FtsQ. Dimeryzację FtsQ przez jej Region transmembrany (lub reszty C-końcowe 30) obserwowano w eksperymencie z dwoma hybrydami bakteryjnymi18,35. W przeciwieństwie do tego, przeprowadzono bezpośrednie doświadczenie w celu określenia oligomerycznego stanu FtsQ w roztworze, stosując ultracentryfugację analityczną, wskazując, że ftsq jest monomerem 19. Nie możemy jednak wykluczyć możliwości, że region transmembrany ftsq wpływa na stan oligomeryzacji FtsQ, ponieważ eksperyment ultracentryfugacji analitycznej przeprowadzono przy użyciu regionu peryplazmicznego FtsQ19. Mimo że wykorzystaliśmy również regiony peryplazmiczne ftsq, FtsQB i FtsQBL, postawiliśmy hipotezę, że ich Stany oligomeryczne w roztworze zależą od stężenia i że dalsza oligomeryzacja może wystąpić w wysokich stężeniach. W celu analizy zależnych od stężenia Stanów oligomerycznych ftsq, FtsQB lub FtsQBL w roztworze przeprowadzono analityczną filtrację żelową przy użyciu kolumny Superdex 200 (10/300 GL) i porównano eksperymentalne promienie Stokesa (Rh) z tymi obliczonymi na podstawie modeli strukturalnych (Fig. S7). Modele struktury ftsq, FtsQB i FTSQBL do obliczania wartości RH zostały wygenerowane na podstawie naszej struktury krystalicznej FtsQB i struktury SAXS ftsqbl, jak opisano poniżej. Niewidoczne segmenty N-I C-termini ftsq, FtsB i FtsL były modelowane jako elastyczne pętle (dodatkowe rys. S7).

dla wysokich i niskich stężeń ftsq50–276 (odpowiednio 370 i 18,5 µM), pozorny RH (odpowiednio 3,03 i 2,83 nm) był bliższy teoretycznemu RH monomeru ftsq50–276 (2,90 nm), co sugeruje, że FtsQ występuje głównie jako monomer w roztworze (Fig. 5). W przeciwieństwie do tego, dla kompleksu FtsQB, pozorny RH (4,33 nm) był bliżej do heterotetrameru 2:2 ftsqb (4,87 nm) w wysokich stężeniach (138 µM), podczas gdy pozorny RH (3,12 nm) był bliżej do heterodimeru 1:1 ftsqb (3,49 nm) w niskich stężeniach (8 µM; Fig. 5). W celu dalszego wsparcia modelu heterotetramerowego 2: 2 FtsQB, masę cząsteczkową FtsQB w wysokich stężeniach (138 µM) mierzono za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar z wielokątnym rozpraszaniem światła (SEC-MALS). Rzeczywiście, Masa cząsteczkowa FtsQB była zgodna z kompleksem 2: 2 FtsQ i FtsB (Fig. 1C). Wyniki te sugerują, że ftsb pośredniczy w dimeryzacji FtsQB, ponieważ ftsq istnieje jako monomer w wysokich i niskich stężeniach. Dla kompleksu FtsQBL formy heteroheksameryczne i heterotrimeryczne eluowano oddzielnie podczas filtracji żelowej podczas oczyszczania i zebrano oddzielnie. Każda forma była stabilna, jak wskazano w SEC-MALS (Fig. 1C), a następnie wykorzystywane do analizy analitycznej filtracji żelu. Przy wysokich i niskich stężeniach kompleksu FtsQBL (odpowiednio 6,8–20 µM i 101-200 µM) pozorne wartości RH heteroheksamerycznego FtsQBL były bliższe wartościom 2:2:2 model FtsQBL (5,59 nm), podczas gdy wartości RH heterotrimerycznych FtsQBL były bliższe wartościom modelu 1: 1: 1 FtsQBL (4,28 nm) (rys. 5). Sugeruje to, że zarówno heteroheksameryczne, jak i heterotrimeryczne formy FtsQBL istnieją w stabilnej formie niezależnie od ich stężenia.

Rysunek 5

oligomeryzacja zależna od stężenia ftsq50-276 / FtsB25-103. (A) analityczne profile filtracji żelowej ftsq50–276 (fioletowy), ftsq50–276/ftsb25–103 (czerwony), heterotrimer ftsqbl (jasnozielony) i heteroheksamer ftsqbl (ciemnozielony) przy wysokich (101-370 µM; linie stałe i lewa oś y) i niskich (6,8-20 µM; linie kropkowane i prawa oś y) stężeniach. B) podsumowanie analizy hydrodynamicznej na Fig. 5A. wartości RH z kolumny porównano z wartościami obliczonymi z modeli konstrukcyjnych (rys. uzupełniająca). S7) za pomocą programu HYDROPRO.

Organizacja strukturalna tetrameru ftsqb

następnie zbadaliśmy organizację strukturalną heterotetrameru ftsqb w rozwiązaniu. Kiedy ocenialiśmy opakowanie kryształowe kompleksu ftsqb, potencjalny heterotetramer ftsqb został wygenerowany przez operacje symetrii krystalograficznej i wykazywał wydłużoną strukturę o ogólnych wymiarach 30 × 40 × 150 Å, tak że heterodimer ftsqb dimeryzował się w antyrównoległy sposób head-to-head poprzez n-końcowe α-domeny podjednostek ftsq (dodatkowe rys. S7C). Chociaż spekulowaliśmy, że FtsQB tworzy większy oligomer poprzez FtsB w oparciu o analityczne dane z filtracji żelowej, nie mogliśmy wykluczyć możliwości, że heterotetramer FtsQB w roztworze został utworzony przez ten sam interfejs obserwowany w kontakcie z kryształem. W ten sposób zbadaliśmy, czy interfejs krystalograficzny jest zaangażowany w formowanie heterotetrameru FtsQB. Na styku dimerów FtsQ, ściśle zachowane pozostałości Leu57 i Phe87 tworzą hydrofobowy rdzeń na styku (dodatkowe rys. S2A); dlatego postawiliśmy hipotezę, że mutant FTSQB l57r lub f87a istnieje jako heterodimer niezależnie od jego stężenia, jeśli Leu57 i Phe87 są kluczowymi pozostałościami dla montażu heterotetrameru FtsQB. Jednak zarówno mutanty l57r, jak i f87a zmontowane w heterotetramer 2:2 tylko w wysokich stężeniach (dodatkowa Fig. S8), co sugeruje, że obserwowany heterotetramer FtsQB w roztworze nie został utworzony przez N-końcowe α-domeny podjednostek FtsQ.

następnie postawiliśmy hipotezę, że zwinięty obszar cewki ftsb jest odpowiedzialny za dimeryzację heterodimerów FtsQB. W tym przypadku przewidzieliśmy, że łamający helisę mutant L46P ftsqb hamuje dimeryzację heterodimerów FtsQB. Rzeczywiście, niektóre części mutanta ftsqb l46p gromadzą się w heterodimery 1: 1, nawet w wysokich stężeniach (dodatkowe rys. S8). Wyniki te sugerują, że zwinięty obszar cewki FtsB ma kluczowe znaczenie dla montażu heterotetrameru FtsQB w roztworze. W 2:2 Model heterotetramerowy ftsqb, N-końcowe Kierunki obu podjednostek ftsb są zorientowane w tym samym kierunku, a zatem region transmembrany FtsB może również dimeryzować, aby ułatwić homodimeryzację pełnej długości FtsB. Może to wyjaśniać, dlaczego oligomeryzacja wyższego rzędu ftsqb była obserwowana tylko w wysokich stężeniach. Zgodnie z naszymi ustaleniami, w poprzednim badaniu odnotowano, że ftsb samo-kojarzy się za pomocą peryplazmicznej zwojnicy i regionów transmembrany 26. Dla wysokich i niskich stężeń e5–FtsB25-103/k5–FtsL64-121 (odpowiednio 191 i 22,2 µM), pozorny RH (oba 4.50 nm) był bliższy teoretycznemu RH heterotetrameru 2:2 E5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (4,38 nm), co sugeruje, że e5-FtsB25–103/k5-ftsl64–121 występuje głównie jako heterotetramer w roztworze (dodatkowa Fig. S8). Zgodnie z tym niedawne badanie z wykorzystaniem analizy progu i metod obliczeniowych wykazało również, że kompleks FtsBL tworzy tetramer36.

struktura SAXS kompleksu FtsQBL

aby określić ogólną konformację kompleksu ftsqbl w rozwiązaniu, zebrano dane SAXS. 1:1: 1 lub 2: 2:2 kompleks FtsQBL wykorzystano do określenia struktury ab initio otoczki molekularnej odpowiednio w niskich i wysokich stężeniach (Fig. 6a i dodatkowe rys. S9). Co ciekawe, ogólna koperta kompleksu FtsQBL 2: 2: 2 pokazała wydłużony kształt „Y” (rys. 6a). Mimo że koperta nie pokazała wystarczających szczegółów, aby ustawić poszczególne domeny FtsQ, FtsB i FtsL, zauważyliśmy, że duża koperta o wklęsłej powierzchni pasuje dość dobrze do kształtu FtsQ (rys. 6a). Aby włączyć dwie cząsteczki FtsQ do dużej koperty o wklęsłej powierzchni, N-końcowe Kierunki ftsq i FtsBL powinny być przeciwne. Było to nieoczekiwane, ponieważ poprzednie modele utworzone przez inne grupy posiadały N-końcowe helisy transbłonowe zorientowane w tym samym kierunku20. Struktura krystaliczna kompleksu ftsq50–276/ftsb25–103 została pomyślnie włączona do koperty molekularnej (Fig. 6a i dodatkowe rys. S9), wskazując, że ogólna konformacja kompleksu FtsQ50–276-FtsB25-103 jest dość sztywna w rozwiązaniu. Dodatkową powłokę przypisano do pozycji cewki heterotetramerycznej i cewek ftsbl e5 i K5 (rys. 6a). Niedawno zasugerowano, że subkompleks FtsBL jest heterotetramerem 2:2 z nieprzerwaną helisą ftsl łączącą transmembrane i peryplazmiczną spiralę36; dlatego FtsQBL w kształcie litery Y może dobrze pasować do zakrzywionej membrany w celu zakotwienia membrany (Fig. 6b). Ze względu na niską rozdzielczość obwiedni SAXS trudno było jasno określić montaż strukturalny FtsQBL, dlatego konieczne jest dalsze określenie struktury. Chociaż zaobserwowaliśmy 2:2 heterotetramer ftsqb i 2: 2: 2 heteroheksamer ftsqbl powstawanie in vitro, czy te formy istnieją in vivo pozostaje niejasne i konieczne są dalsze badania w celu ujawnienia fizjologicznej stechiometrii dzielnika. Należy jednak zauważyć, że FtsQBL zostało wcześniej zaproponowane do utworzenia kompleksu 2: 2: 2 w divisomie37. Chociaż potrzebne są dodatkowe badania, aby w pełni zrozumieć strukturę organizacji FtsQBL w zespole divisome, nasze dane stanowią podstawę do dalszych badań.

Rysunek 6

struktura rozwiązania SAXS ftsqbl i ogólny model kompleksu FtsQBL. A) struktury rozwiązania SAXS trimera ftsqbl 1: 1: 1 i heksameru 2: 2: 2. Modele strukturalne kompleksów FtsQBL (1:1:1 i 2:2:2) zrekonstruowano za pomocą programu ab initio shape determination program DAMMIF. Dla każdego białka wygenerowano 10 niezależnych modeli, porównano i obliczono uśredniony model za pomocą programu DAMAVER. Renderowanie powierzchni modeli konstrukcyjnych uzyskano za pomocą programu PyMOL. Aby porównać ogólne kształty i wymiary, schemat wstęgowy modeli atomowych białek ftsqbl nałożono na zrekonstruowane modele atomu za pomocą programu SUPCOMB. NSD = 7,039 dla modelu 1:1:1 i 3,800 dla modelu 2: 2: 2. B) ogólny model Ftsqbl w kształcie litery Y. Pokazano Stowarzyszenie FtsQBL poprzez rekrutację kompleksu FtsBL do FtsQ. Każdy łańcuch jest reprezentowany w innym kolorze.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.