Estrutural Insights sobre o FtsQ/FtsB/FtsL Complexo, um Componente-Chave do Divisome

interações Intermoleculares de FtsQ e FtsB

estudos Anteriores mostraram que o periplasmic subcomplex de FtsB e FtsL pode ser reconstituído por substituir a membrana regiões de ambas as proteínas com oposta carregadas, solúvel enrolada em bobinas (e5 e k5 na Fig. 1A) 20,21,22. Utilizando esta técnica, um complexo binário estável (FtsBL) constituído por FtsB e FtsL foi reconstituído por co-expressão de e5-FtsB25–103 e k5-FtsL64–121 em células de E. coli (Fig. 1A E Fig. suplementar. S2). O complexo ternário (FtsQBL) consistindo de FtsQ, e5-FtsB, e k5-FtsL foi reconstituída pela mistura de uma molhado pellet de células contendo overexpressed FtsQ50–276 e um pellet de células contendo overexpressed e5-FtsB25–103 e k5-FtsL64–121. Os complexos FtsBL e FtsQBL foram co-eluídos de uma coluna de afinidade e co-migraram em colunas de exclusão de tamanho (Fig. 1B, C). O complexo ftsq50–276-FtsB25–103 estável foi formado (Fig. 1B), mas o FtsQ não tinha afinidade de ligação com o k5-FtsL64–121 na ausência do E5-FtsB25–103 (dados não apresentados), consistente com o estudo anterior20. Precisamente o mapa de ligação região entre FtsQ e FtsB, duas construções (FtsB25–60 e FtsB61–103) com truncado N – ou C-terminal regiões de FtsB25–103 foram concebidos e suas interações com FtsQ50–276 foram analisadas em um bio-camada de interferometria (BLI) experimento (Fig. 1D). FtsQ50-276 ligado ao complexo FtsB25-103 com uma constante de dissociação (KD) de 0,67 µM (Fig. 1D). Entre os dois FtsB construções (FtsB25–60 e FtsB61–103), apenas FtsB61–103 ligação para FtsQ50–276 foi estável (KD = 0,9 µM), sugerindo que o C-terminal região de FtsB (principalmente resíduos 61-103) contribui para FtsQ de ligação (Fig. 1D), consistente com um resultado anterior que o C-terminus do FtsB é necessário para a interação com o FtsQ25. Embora outro estudo anterior tenha sugerido que uma região membrana-proximal do FtsQ é outro hotspot de interacção para o ftsb binding23,a ligação estável do FtsQ50-276 com o FtsB25-60 não foi observada no nosso ensaio (Fig. 1D).

Figura 1

o Mapeamento de FtsQ-FtsB-FtsL ligação região. A) arquitectura de domínio de FtsQ, FtsB e FtsL. As construções são indicadas por linhas cinzentas e a reconstituição de ftsb e FtsL utilizando bobinas e5 e k5 é apresentada. (B) SDS-PAGE de FtsQ50–276, FtsQ50–276/FtsB25–103, e FtsQ50–276/e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (FtsQBL) complexos. Géis de página SDS foram visualizados usando Coomassie Blue. (C) FtsQBL heterohexamer (3 mg/mL, luz, linha verde), FtsQBL heterotrimer (3 mg/mL, linha vermelha), FtsQB (10 mg/mL, linha azul), e FtsQ (10 mg/mL, linha preta) foram analisados pela SEC-MALS. A linha espessa representa a massa molecular medida. D) os ensaios BLI representativos do FtsQ50–276 com o FtsB25–103, O FtsB61–103 e o FtsB25–60. Os sensorgramas BLI com diferentes concentrações de analitos são indicados por cores diferentes. A análise de equilíbrio e o KD calculado são apresentados para cada construção em painéis à direita. As experiências foram repetidas três vezes.

estrutura cristalina do FtsQ-FtsB complexo

Para obter mais insights sobre a organização estrutural do FtsQB complexo, determinou-se o 2.9-Å de resolução estrutura de FtsQ50–276 vinculado a FtsB25–103 (Fig. 2, Supplementary Fig. S3, e Quadro 1). O elétron mapa de densidade de resíduos 25-60 não foi observado para FtsB25–103, enquanto quase todas as sequências de FtsQ50–276 foram encontrados para ser encomendados com exceção do N – e C-terminal flexível regiões (resíduos 50-52 e 262-276, respectivamente; Fig. 2A e Fig. suplementar. S3). Consistentemente, o mapa de densidade de elétrons de FtsB n-terminus (resíduos 22-63) não foi observado para FtsB na estrutura cristalina do complexo FtsQB, que foi relatado recentemente por outro grupo 26. Uma possibilidade em relação à falta de densidade de elétrons é que a hélice membrana-proximal está desordenada no cristal do complexo FtsQB; no entanto, a estrutura cristalina dos 30 aminoácidos de membrana de FtsB mostrou que forma um coil27 cônico enrolado, portanto excluímos esta possibilidade. Outra possibilidade é que a hélice membrana-proximal é clivada automaticamente durante a purificação e cristalização, de tal forma que a construção restante (FtsQ50–276-FtsB61–103) cristaliza facilmente. Dado que as simulações anteriores da dinâmica molecular do complexo FtsQBL mostraram que a parte central do FtsB em torno do resíduo Leu60 apresenta uma helix-break28, previmos que a parte central do FtsB em torno de Leu60 é propensa à proteólise.

Figura 2

estrutura Geral do FtsQ50–276/FtsB25–103 complexo. A) diagramas estéreo da fita do complexo FtsQB. O mapa de densidade de elétrons dos resíduos 61-95 só foi observado para FtsB25-103. Cada corrente é mostrada em uma cor diferente. (B,C) vista estéreo ampliada mostrando detalhes da interação na interface de FtsQ e FtsB. Cada corrente é mostrada em uma cor diferente.

Quadro 1 estatísticas de recolha e aperfeiçoamento de dados.

A estrutura geral do FtsQ50–276 consiste em dois domínios, α e β, e β-domínio é responsável por FtsB25–103 ligação (Fig. 2A). A área de superfície Acessível a solventes enterrada na interface entre o FtsQ e o FtsB foi de 1330 Å2, aproximadamente 20% da área de superfície monomérica do FtsQ. Além disso, aproximadamente 50% dos átomos não-hidrogenados na interface entre FtsQ e FtsB são polares, como indicado pelas calculações da área de superfície da isovelocidade proximal29. A sequência FtsB (resíduos 61-95) dobra-se numa α-hélice (α3) e numa β-strand (β1; Fig. 2A). O motivo da cadeia α-helix-turn-β inicia-se com a cadeia α-helix (resíduos 64-75), seguida de um ciclo cindido (resíduos 76-82), um ciclo β curto (resíduos 83-85) e outro ciclo cindido terminal (resíduos 86-95; Fig. 2C); os dois laços kinked contêm dois resíduos de prolina (Pro80 e Pro89; Fig. 2C). Curiosamente, o FtsQ α5 helix adota uma forma kinked incorporando Pro228 no meio e esta forma parece ser crucial para seus extensos contatos com o FtsB. Quando Tyr precede Pro na sequência de aminoácidos, aumenta a tendência do resíduo Pro para tomar uma conformação cis30; no entanto, o resíduo Pro228 do FtsQ adota uma trans conformação (Fig. 2C).Apesar de anteriores análises espectrométricas de massa por cruzamento de fotos indicarem que as regiões c-terminais de FtsQ e FtsB são pontos críticos de interação crucial, as interações detalhadas propostas pela análise espectrométrica de massa foram completamente diferentes das observadas em nossa estrutura cristalina (Fig. 2). Com base na massa de espectrometria de análise, foi sugerido que o C-terminal da FtsB em torno de Met77 resíduo formas β-folha-como a interação com o C-terminal de fio de FtsQ em torno de Gly255 residue23. Em contraste com estes dados, nossa estrutura cristalina mostrou que a região em torno de Met77 resíduos de FtsB não forma uma estrutura secundária, e a direção de sua cadeia lateral é oposta à região de ligação esperada de FtsQ (Fig. 2C). Na nossa estrutura cristalina, a região C-terminal do FtsB (resíduos 61-103) interage extensivamente com o domínio β Do FtsQ e contribui principalmente para a ligação do FtsQ. O laço kinked entre a α-helix (residues 64-75) e a β-strand (residues 83-85) envolve o resíduo Tyr248 de FtsQ (Fig. 2B). Para estabilizar a conformação do laço kinked, quatro resíduos FtsB (Glu68, Arg72, Arg79, e Glu82) formam um aglomerado com extensas redes de Ponte salina (Fig. 3A). FtsB Glu68 formas sal pontes com tanto Arg72 (2.8 Å) e Arg79 (2.8 Å), enquanto Arg72 forma um sal ponte com Glu82 (2.8 Å e 3.0 Å, respectivamente; Fig. 3A); o átomo Arg72 NH2 forma uma interacção adicional com o átomo Glu68 OE2 (2,8 Å; Fig. 3A). O aglomerado de Ponte de sal de FtsB é crucial na formação da ligação de hidrogênio (2,7 Å) entre o átomo de oxigênio de FtsQ Tyr248 e o átomo NH1 de FtsB Arg72 (Fig. 3A). Além disso, FtsB Glú69 forma uma ponte salina com FtsQ Arg196 (2.3 Å; Fig. 3A). Curiosamente, a cadeia β Do FtsB faz uma folha β contínua com a do FtsQ por empilhamento anti-paralelo com β12(Fig. 2C). FtsB Phe84 formulários de contatos próximos com FtsQ Tyr248, considerando que Tyr85 reside nas proximidades do núcleo hidrofóbico da FtsQ β-domínio que consiste Leu226, Leu230, Val254, e Trp256 (Fig. 2B). FtsB Leu87 também forma extensos contatos com FtsQ Leu226 e a porção alifática de Arg222 (Fig. 2C).

Figura 3

interações Moleculares do FtsQB complexas no detalhe. (A) Visualizações ampliadas mostrando interações detalhadas nas interfaces FtsQ e FtsB. São apresentados diagramas de fita de FtsB e diagramas de superfície de FtsQ. Superfícies vermelhas indicam resíduos 100% conservados de FtsQ (Fig. suplementar. S2). (B) Representante da BLI ensaios de FtsQ-FtsBL complexo WT e mutantes (FtsQ Y248A, FtsB E68A, FtsB E69R, FtsB R72E, e FtsB E82R). Os sensorgramas BLI com diferentes concentrações de analitos são indicados por cores diferentes. A análise de equilíbrio e o KD calculado são apresentados para cada construção em painéis à direita.

Para avaliar as contribuições de interfacial resíduos da FtsQB complexo, o interfacial conservada resíduos de FtsQ (Tyr248) e FtsB (Glu68, Glu69, Arg72, e Glu82) foram mutantes e suas interações foram examinados pela BLI. As afinidades de ligação entre FtsQ e FtsB foram medidas por imobilização de tipo selvagem (WT) ou mutantes de GST-e5-FtsB em complexo com k5-FtsL. Como esperado, a mutação dos resíduos interfaciais resultou em grandes reduções na afinidade em comparação com WT (KD = 0, 24 µM). O valor KD do mutante Y248A não pôde ser medido devido à fraca ligação, enquanto que o E68A reduziu a afinidade em cerca de 10 vezes (Fig. 3B). As mutações de reversão de carga E69R, R72E e E82R do FtsB quase aboliram a ligação ao FtsQ (Fig. 3B). Isto destaca o papel do FtsQ Tyr248 e o tema da cadeia de afinidade FtsB α-helix-turn-β-como determinantes da afinidade.Para verificar a ligação in vitro das regiões periplásmicas de FtsB e FtsQ, realizámos um ensaio bacteriano de dois híbridos com base numa sinalização cíclica de AMP cascade31. Como N-terminus da proteína T18 ou T25 fundida FTS era tóxica para a E. coli e tem um certo grau de problema de instabilidade, construímos proteínas C-terminus-fundidas Fts (T25-FtsQ, T18-FtsB)18. A estirpe de E. coli BTH101 reporter foi co-transformada com um par de plasmídeos indicados e a eficácia de ligação foi determinada pelo ensaio Da β-galactosidase(Fig. 4A). Como mostrado na Fig. 4A, WT FtsB, e WT FtsQ interagiram entre si. Tal como no ensaio BLI, o FtsB (E68A) pode ligar-se ao FtsQ WT, enquanto a afinidade de ligação foi reduzida aproximadamente duas vezes em comparação com o FtsB WT. As proteínas mutadas, com excepção da FtsB (E68A), diminuem a sua capacidade de interagir com A WT FtsQ. É consistente com resultados de ligação in vitro, indicando que os resíduos interfaciais de FtsQ (Y248) e FtsB (E69, R72 e E82) desempenham um papel importante na formação do complexo FtsQB.

Figura 4

interações Moleculares do FtsQB complexo in vivo. A) o efeito das mutações nos resíduos interfaciais de FtsQ e FtsB. Os pares plasmídeos indicados foram introduzidos numa estirpe repórter E. coli BTH101. As interacções do FtsB e do FtsQ foram avaliadas pelo sistema bacteriano de dois híbridos. As actividades de ligação foram medidas pelo ensaio β-galactosidase e apresentadas como unidade Miller. Ф, espinha dorsal do plasmídeo; B, ftsB; Q, ftsQ; *p < 0.05, **p < 0,005, em comparação com o grupo de expressar T18 fundida WT FtsB e T25 fundida FtsQ proteína. B) comparação da estabilidade entre WT e proteínas mutadas. E. coli MG1655 abrigando plasmídeo pUHE21-2-lacIq codificando C-terminal WT marcado ou proteína mutante foi amostrada nos pontos de tempo indicados após a adição de cloranfenicol e submetida à coagulação Ocidental. DnaK foi usado como controle de carga. C) o efeito in vivo das mutações pontuais sobre o FtsQ e o FtsB. A função da WT e das proteínas mutadas foi avaliada pela PNA conjugada com peptídeo (PPNA). As estirpes de E. coli MG1655 que abrigam os plasmídeos indicados foram tratadas com PPNA, sequências complementares no cromossoma E. coli, mas não nos plasmídeos indicados. As CFO foram medidas após 3 horas de tratamento com ANP. São indicadas diferenças significativas de UFC em comparação com o grupo de controlo que expressa o ftsB WT ou o ftsQ. *p < 0.05, **p < 0.005, N. S. não significativa em comparação com a ftsB; # p < 0.05 comparado com ftsQ; N. T. não tratada.

a interacção entre FtsQ e FtsB é necessária para o recrutamento de proteínas Fts a jusante. Quando o FtsQ ou o FtsB se esgotam ou são introduzidos com mutação deletéria, leva à filamentação e, eventualmente, à morte das células. Para avaliar a função in vivo dos resíduos interfaciais FtsQB, realizámos um ensaio de viabilidade das células que expressam WT ou proteínas mutadas com ácidos nucleicos peptídicos (PNAs). Um estudo anterior mostrou que os PNAs conjugados com peptídeo (PPNAs) que visam genes essenciais tinham efeitos bactericidas nas células de E. coli32,33,34. Sabe-se que o local de ligação do ribossoma é um local-alvo chave para a inibição da translação32. Uma vez que a ligação apertada da PNA ao ARNm interfere com a função ribossómica, a tradução de proteínas é evitada 33. Com base nestes princípios, concebemos quatro PPNAs antissensivos que são complementares aos sites de iniciação de tradução do ftsB e do ftsQ (Fig suplementar. S4). O crescimento da estirpe E. coli MG1655 foi medido para examinar os efeitos inibitórios do antisense PPNA1, PPNA2, PPNA3 e PPNA4. foi observado o crescimento bacteriano fortemente inibido e a filtração de E. coli (Figs S4 e S5 suplementares). Assim, utilizámos o PPNA1 e o PPNA3 para outras experiências. Construímos inflamação induzida por plasmídeos expressar WT FtsB, WT FtsQ, FtsB mutantes (E68A, E69R, R72E, e E82R), e FtsQ mutante (Y248A). Uma vez que os PPNAs usados não têm sequências complementares dos plasmídeos recombinantes, não interferem com a expressão proteica nos plasmídeos. As estirpes que exprimem proteínas WT ou mutadas não mostraram diferenças significativas nas unidades formadoras de colónias (UFC) a 3 h sem PPNA. Células que expressam o PESO de proteínas (FtsB ou FtsQ) no plasmídeo recuperado o crescimento bacteriano quando tratados com PPNA, mas a célula expressando a proteína mutante não recuperar o crescimento, exceto para o FtsB (E68A) (Fig. 4C). Além disso, foi observada filamação em bactérias que expressam proteínas mutadas sem a capacidade de recuperar o crescimento quando tratadas com PPNA (Figo suplementar. S5). Para excluir a possibilidade de que a estabilidade da proteína possa afetar a função da proteína mutada, determinamos também a estabilidade da proteína in vivo bloqueando a síntese da proteína de novo. O plasmídeo de codificação FtsB ou FtsQ fundida com a Sua marca no C-terminal foi introduzido em E. coli MG1655, e a estabilidade da proteína mutante foi comparado com WT FtsB ou FtsQ (Fig. 4B e Fig. suplementar. S6). Como resultado, as proteínas mutadas, com exceção do FtsB (E68A), apresentaram resultados semelhantes aos do WT. Embora o FtsB (E68A) fosse instável em comparação com o FtsB WT, esta proteína mutante FtsB (E68A) pode complementar a função do FtsB WT e interagir com o FtsQ. Tomados em conjunto, sugerem que as mutações do interfacial conservada resíduos de FtsQ (Y248) e FtsB (E69, R72, e E82) não afetam a proteína de estabilidade, mas abolir a interação entre FtsB e FtsQ.

Procianidinas estados de FtsQB e FtsQBL em solução

Anteriormente, resultados contraditórios foram relatados para o procianidinas estado do FtsQ proteína. A dimerização do FtsQ através da sua região transmembranar (ou resíduos C-terminal 30) foi observada numa experiência bacteriana de dois híbridos 18,35. Em contraste, um experimento direto para determinar o estado oligomérico do FtsQ em solução foi realizado usando ultracentrifugação analítica indicando que o FtsQ é um monomer19. No entanto, não podemos excluir a possibilidade de que a região transmembranar do FtsQ afeta o estado de oligomerização do FtsQ, uma vez que a experiência de ultracentrifugação analítica foi realizada usando a região periplásmica do FtsQ19. Embora nós também usamos a periplasmic regiões de FtsQ, FtsQB, e FtsQBL, trabalhamos com a hipótese de que seus procianidinas estados em solução depende da concentração e que mais oligomerização pode ocorrer em altas concentrações. Para analisar a concentração-dependente procianidinas estados de FtsQ, FtsQB, ou FtsQBL na solução analítica de gel filtração foi realizada utilizando um Superdex 200 (10/300 GL) coluna e experimental de Stokes raios (RH) foram comparados com os calculados a partir de modelos de estrutura (Complementar Fig. S7). Modelos de estrutura de FtsQ, FtsQB e FtsQBL para o cálculo dos valores de RH foram gerados com base na nossa estrutura cristalina de FtsQB e estrutura de SAXS de FtsQBL como descrito abaixo. Os segmentos invisíveis do N-E C-termini de FtsQ, FtsB e FtsL foram modelados como loops flexíveis (figura suplementar. S7).

Para baixas e altas concentrações de FtsQ50–276 (370 18,5 µM, respectivamente), a aparente RH (3.03 e 2.83 nm, respectivamente) foi mais próximo do teórico RH de FtsQ50–276 monômero (2.90 nm), sugerindo que FtsQ, principalmente, existe como um monômero em solução (Fig. 5). Em contraste, para o FtsQB complexo, a aparente RH (4.33 nm) foi o mais perto que da 2:2 FtsQB heterotetramer (4.87 nm) em altas concentrações (138 µM), enquanto que a aparente RH (3.12 nm) foi próxima de 1:1 FtsQB heterodimer (3.49 nm) em baixas concentrações (8 µM; Fig. 5). Para apoiar ainda mais o modelo heterotetramer 2: 2 FtsQB, o peso molecular de FtsQB em concentrações elevadas (138 µM) foi medido por cromatografia de exclusão de tamanho com dispersão de luz multi-ângulo (SEC-MALS). Na verdade, a massa molecular de FtsQB foi consistente com um complexo 2:2 de FtsQ e FtsB (Fig. 1C). Estes resultados sugerem que o FtsB mediata a dimerização do FtsQB uma vez que o FtsQ existe como um monómero em concentrações elevadas e baixas. Para o complexo FtsQBL, as formas heterohexamérica e heterotrimérica foram eludidas separadamente na filtração de gel durante a purificação e foram coletadas separadamente. Cada forma era estável como indicado pelos SEC-MALS (Fig. 1C), e ainda utilizado para a análise da filtração analítica do gel. Em concentrações elevadas e baixas do complexo FtsQBL (6,8–20 µM e 101-200 µM, respectivamente), os valores RH aparentes de FtsQBL heterohexamérico estavam mais próximos dos 2: 2:2 ftsqbl model (5.59 nm), while the RH values of heterotrimeric FtsQBL were closer to that of the 1:1:1 FtsQBL model (4.28 nm) (Fig. 5). Isto sugere que ambas as formas heterohexaméricas e heterotriméricas de FtsQBL existem em uma forma estável independentemente de suas concentrações.

Figura 5

Concentração-dependente de oligomerização de FtsQ50–276/FtsB25–103. (A) Analítico de gel filtração perfis de FtsQ50–276 (roxo), FtsQ50–276/FtsB25–103 (vermelho), FtsQBL heterotrimer (luz verde), e FtsQBL heterohexamer (verde escuro) em alta (101-370 µM; linhas sólidas e esquerda do eixo y) e baixa (6.8–20 µM; linhas pontilhadas e para a direita do eixo y) concentrações. B) Resumo da análise hidrodinâmica na Fig. Os valores de 5A. RH da coluna foram comparados com os calculados a partir de modelos de estrutura (Figo suplementar. S7) usando o programa HIDROPRO.

organização Estrutural do FtsQB tetramer

próxima examinado organização estrutural do FtsQB heterotetramer em solução. Quando avaliamos o cristal embalagem do FtsQB complexo, um potencial FtsQB heterotetramer foi gerada através de simetria cristalográfica operações e exibiu uma estrutura alongada, com dimensões de 30 × 40 × 150 Å, de tal forma que o FtsQB heterodimer dimerized em um antiparallel cabeça-de-cabeça de moda, através da N-terminal α-domínios de FtsQ subunidades (Complementar Fig. S7C). Embora tenhamos especulado que o FtsQB forma um oligómero maior através do FtsB baseado em dados analíticos de filtração em gel, não podíamos descartar a possibilidade de que o heterotetramer em solução do FtsQB fosse formado pela mesma interface observada no contato com o cristal. Assim, examinamos se a interface cristalográfica está envolvida na formação do heterotetramer FtsQB. Na interface dímero de FtsQ, resíduos estritamente conservados de Leu57 e Phe87 formam um núcleo hidrofóbico na interface (Figo suplementar. S2A); portanto, trabalhamos com a hipótese de que o FtsQB L57R ou F87A mutante existe como um heterodimer independentemente de sua concentração se Leu57 e Phe87 são cruciais de resíduos para a assembleia da FtsQB heterotetramer. No entanto, tanto l57r como F87A mutantes agrupados em um heterotetramer 2: 2 apenas em concentrações elevadas (Fig. suplementar. S8), sugerindo que o heterotetramer FtsQB observado em solução não foi formado através do N-terminal α-domains das subunidades FtsQ.

we next hypothesized that The coiled coiled coil region of FtsB is responsible for the dimerization of FtsQB heterodimers. Neste caso, previmos que um mutante l46p que quebra hélice de FtsQB inibe a dimerização dos heterodímeros FtsQB. Na verdade, algumas porções de mutantes FtsQB L46P se reúnem em heterodímeros 1:1, mesmo em altas concentrações (Fig. suplementar. S8). Estes resultados sugerem que a região da bobina enrolada do FtsB é crucial para a montagem do heterotetramer FtsQB em solução. No 2:2 FtsQB heterotetramer modelo, o N-terminal direções de ambos os FtsB subunidades são orientados na mesma direção, e, assim, a região transmembrana de FtsB também pode dimerize para facilitar homodimerization de comprimento total FtsB. Isto pode explicar porque é que a oligomerização de ordem superior do FtsQB foi observada apenas em concentrações elevadas. Consistente com as nossas descobertas, um estudo anterior relatou que a FtsB se auto-associa através da bobina enrolada periplásmica e regiões transmembranas26. Para concentrações elevadas e baixas de E5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (191 e 22,2 µM, respectivamente), o RH aparente (ambos 4.50 nm) foi mais próximo do teórico RH das 2:2 heterotetramer de e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (4.38 nm), sugerindo que o e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121, principalmente, existe como um heterotetramer em solução (Complementar Fig. S8). De acordo com isso, um estudo recente usando análise FRET e métodos computacionais também mostrou que o complexo FtsBL forma um tetramer36.

SAXS structure of FtsQBL complex

To determine the overall conformation of the FtsQBL complex in solution, SAXS data were collected. O 1: 1: 1 ou 2: 2:O complexo FtsQBL foi utilizado para determinar a estrutura ab initio do envelope molecular em concentrações baixas e elevadas, respectivamente (Fig. 6A e Figo suplementar. S9). Curiosamente, o envelope geral do complexo FtsQBL 2:2:2 mostrou uma forma alongada de “Y”(Fig. 6A). Mesmo que o envelope não mostrar detalhes suficientes para a posição individual de domínios de FtsQ, FtsB, e FtsL, observou-se que a grande envelope com uma superfície côncava ajuste razoavelmente bem com a forma de FtsQ (Fig. 6A). Para incorporar as duas moléculas FtsQ no grande envelope com uma superfície côncava, as direções n-terminais de FtsQ e FtsBL devem ser opostas. Isto foi inesperado, uma vez que os modelos anteriores formados por outros grupos possuíam hélices transmembranares n-terminais orientadas na mesma direcção 20. A estrutura cristalina do complexo FtsQ50-276/FtsB25-103 foi incorporada com sucesso no envelope molecular (Fig. 6A e Figo suplementar. S9), indicando que a conformação geral do complexo FtsQ50–276-FtsB25–103 é bastante rígida em solução. O envelope adicional foi atribuído às posições da bobina enrolada heterotetramérica e ftsbl E5-e K5-coils(Fig. 6A). Foi recentemente sugerido que o subcomplex FtsBL é um heterotetramer 2:2 com uma hélice FtsL ininterrupta ligando a transmembrana e o periplasmic coiled coil36; portanto, o FtsQBL em forma de Y pode caber bem na membrana curvada para a fixação de membrana (Fig. 6B). Devido à baixa resolução do envelope SAXS, foi difícil definir claramente a montagem estrutural do FtsQBL; portanto, é necessária uma determinação estrutural adicional. Embora tenhamos observado 2:2 FtsQB heterotetramer and 2: 2: 2 FtsQBL heterohexamer formation in vitro, whether these forms exist in vivo remains unclear and further studies are required to reveal the physiological stoichiometry of the divisome. No entanto, deve-se notar que FtsQBL foi sugerido anteriormente para formar um complexo 2:2:2 no divisome37. Embora sejam necessários estudos adicionais para compreender completamente a organização estrutural do FtsQBL na divisão assembly, os nossos dados fornecem uma base para uma investigação mais aprofundada.

Figura 6

SAXS estrutura de solução de FtsQBL e de um modelo global de FtsQBL complexo. A) SAXS solution structures of FtsQBL 1:1:1 trimer and 2:2:2 hexamer. Modelos estruturais dos complexos FtsQBL (1:1:1 e 2:2:2: 2) foram reconstruídos usando o programa de determinação da forma de ab initio DAMMIF. Para cada proteína, 10 modelos independentes foram gerados, comparados, e um modelo médio foi calculado usando o programa DAMAVER. A renderização da superfície dos modelos estruturais foi conseguida usando o programa PyMOL. Para comparar formas e dimensões globais, o diagrama de fita dos modelos atômicos das proteínas FtsQBL foi sobreposto aos modelos de átomos fictícios reconstruídos usando o programa SUPCOMB. NSD = 7.039 para o modelo 1:1:1 e 3.800 para o modelo 2:2:2. B)modelo global de FtsQBL em forma de Y. A associação FtsQBL, recrutando o complexo FtsBL para o FtsQ, é mostrada. Cada cadeia é representada em uma cor diferente.

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