strukturella insikter i Ftsq/FtsB/FtsL-komplexet, en nyckelkomponent i Divisome

intermolekylära interaktioner mellan FtsQ och FtsB

tidigare studier visade att det periplasmiska subkomplexet av FtsB och FtsL kan rekonstitueras genom att ersätta membranregionerna för båda proteinerna med motsatt laddade, lösliga lindade spolar (E5 och K5 i fig. 1A) 20,21,22. Med hjälp av denna teknik rekonstituerades ett stabilt binärt komplex (FtsBL) bestående av FtsB och FtsL genom att uttrycka e5-FtsB25-103 och k5–FtsL64-121 i E. coli–celler (Fig. 1a och kompletterande Fig. S2). Det ternära komplexet (FtsQBL) bestående av FtsQ, e5-FtsB och k5-FtsL rekonstituerades genom att blanda en våt cellpellet innehållande överuttryckt FtsQ50–276 och en cellpellet innehållande överuttryckt e5-FtsB25–103 och k5-FtsL64–121. Ftsbl-och FtsQBL-komplex var Sam-eluerade från en affinitetskolonn och sammigrerade på kolumner med storlek-uteslutning (Fig. 1B, C). Stabilt ftsq50–276-FtsB25-103-komplex bildades (Fig. 1B), men FtsQ hade ingen bindningsaffinitet med k5-FtsL64-121 i frånvaro av e5–FtsB25-103 (data visas inte), i överensstämmelse med tidigare studie20. För att exakt kartlägga bindningsområdet mellan FtsQ och FtsB designades två konstruktioner (FtsB25–60 och FtsB61–103) med stympade n – eller C-terminala regioner av FtsB25–103 och deras interaktioner med FtsQ50–276 undersöktes i ett Bio-layer interferometry (BLI) experiment (Fig. 1D). Ftsq50–276 bunden till ftsb25-103-komplexet med en dissociationskonstant (KD) på 0,67 kcal (Fig. 1D). Bland de två ftsb–konstruktionerna (FtsB25–60 och FtsB61–103) var endast ftsb61–103-bindning till FtsQ50-276 stabil (KD = 0,9 kg), vilket tyder på att C-terminalområdet för FtsB (främst rester 61-103) huvudsakligen bidrar till ftsq-bindning (Fig. 1D), i överensstämmelse med ett tidigare resultat att C-terminalen för FtsB är nödvändig för interaktion med FtsQ25. Även om en annan tidigare studie föreslog att en membranproximal region av FtsQ är en annan interaktionshotspot för ftsb–bindning23, observerades inte stabil bindning av FtsQ50–276 med FtsB25-60 i vårt experiment (Fig. 1D).

Figur 1

kartläggning av bindningsregionen FtsQ-FtsB-FtsL. (A) Domänarkitektur för FtsQ, FtsB och FtsL. Konstruktioner indikeras med grå linjer och rekonstituering av FtsB och FtsL med e5 – och k5-spolar visas. (B) SDS-sida av ftsq50–276, ftsq50–276/FtsB25–103 och ftsq50–276/e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (ftsqbl) komplex. SDS-PAGE geler visualiserades med hjälp av Coomassie Blue. (C) ftsqbl heterohexamer (3 mg/mL, ljusgrön linje), ftsqbl heterotrimer (3 mg/mL, röd linje), FtsQB (10 mg/mL, blå linje) och FtsQ (10 mg/mL, svart linje) analyserades med SEC-MALS. Den tjocka linjen representerar uppmätt molekylmassa. (D) representativa BLI–analyser av FtsQ50–276 med FtsB25–103, FtsB61–103 och FtsB25-60. BLI sensorgram med olika koncentrationer av analyter indikeras av olika färger. Jämviktsanalys och beräknad KD visas för varje konstruktion vid högra paneler. Experimenten upprepades tre gånger.

kristallstruktur av ftsq-FtsB-komplexet

för att få ytterligare insikter i strukturell organisation av ftsqb-komplexet bestämde vi 2.9–Resolutionsstrukturen för Ftsq50–276 bunden till FtsB25-103 (Fig. 2, Kompletterande Fig. S3 och Tabell 1). Elektrondensitetskartan för rester 25-60 observerades inte för FtsB25–103, medan nästan alla sekvenser av FtsQ50 – 276 befanns beställas med undantag för n-och C-terminala flexibla regioner (rester 50-52 respektive 262-276; Fig. 2a och kompletterande Fig. S3). Konsekvent observerades inte elektrondensitetskartan för FtsB N-terminus (rester 22-63) för FtsB i kristallstrukturen hos FtsQB-komplexet, vilket nyligen rapporterades av annan grupp26. En möjlighet angående bristen på elektrontäthet är att membran-proximal helix är störd i Kristallen i FtsQB-komplexet; emellertid visade kristallstrukturen hos de 30 juxta-membranaminosyrorna i FtsB att den bildar en kanonisk lindad coil27, så vi utesluter denna möjlighet. En annan möjlighet är att den membran-proximala spiralen klyvs automatiskt under rening och kristallisering, så att den återstående konstruktionen (FtsQ50–276-FtsB61–103) kristalliserar lätt. Med tanke på att tidigare molekyldynamiksimuleringar av ftsqbl-komplexet visade att den centrala delen av FtsB runt Leu60-återstoden presenterar en helix-break28, förutspådde vi att den centrala delen av FtsB runt Leu60 är benägen att proteolys.

Figur 2

övergripande struktur för ftsq50–276 / FtsB25-103-komplexet. (A) Stereobanddiagram över ftsqb-komplexet. Elektrondensitetskartan för rester 61-95 observerades endast för FtsB25-103. Varje kedja visas i en annan färg. (B,C) förstorad stereovy som visar detaljer om interaktionen vid gränssnittet mellan FtsQ och FtsB. Varje kedja visas i en annan färg.

Tabell 1 datainsamling och förädlingsstatistik.

den övergripande strukturen för FtsQ50 – 276 består av två domäner, exporterar och exporterar, och exporterar-domänen är ansvarig för ftsb25–103 bindning (Fig. 2A). Den lösningsmedelsåtkomliga ytarean begravd vid gränssnittet mellan FtsQ och FtsB var 1330 Occur2, ungefär 20% av monomerytan för FtsQ. Vidare är cirka 50% av icke-väteatomerna i gränssnittet mellan FtsQ och FtsB polära, vilket indikeras av proximala isovelocity ytarea beräkningar29. Ftsb-sekvensen (rester 61-95) viks in i en gastronomi-helix (OC-3) och en OC-sträng (oc-1; Fig. 2A). Motivet börjar med motivet för den bakre delen av 24-75 (rester av 66-85), följt av en knäppt slinga (rester av 76-82), en kort sträng av den bakre delen av 83-85) och en annan terminal knäppt slinga (rester av 86-95; Fig. 2C); de två Kinkade slingorna innehåller två prolinrester (Pro80 och Pro89; Fig. 2C). Intressant nog antar ftsq jacob5 helix en kinkad form genom att införliva Pro228 i mitten och denna form verkar vara avgörande för dess omfattande kontakter med FtsB. När Tyr föregår Pro i aminosyrasekvensen ökar tendensen hos Pro-återstoden att ta på sig en cis-konformation30; Pro228-återstoden av FtsQ antar emellertid en trans-konformation (Fig. 2C).

Bindningslägen för FtsQ i komplex med FtsB

även om tidigare masspektrometrisk analys med fotokorsbinkning indikerade att C-terminala regioner av FtsQ och FtsB är avgörande interaktionshotspots, var de detaljerade interaktioner som föreslagits av masspektrometrisk analys helt annorlunda än de som observerats i vår kristallstruktur (Fig. 2). Baserat på den masspektrometriska analysen föreslogs att C-änden av FtsB runt Met77-återstoden bildar en akrylliknande interaktion med C-terminalsträngen av FtsQ runt Gly255-återstoden 23. I motsats till dessa data visade vår kristallstruktur att regionen runt Met77-återstoden av FtsB inte bildade en sekundär struktur, och riktningen för dess sidokedja är motsatt den förväntade bindningsregionen för FtsQ (Fig. 2C). I vår kristallstruktur interagerar C-terminalregionen av FtsB (rester 61-103) i stor utsträckning med ftsq-domänen för ftsq och bidrar främst till ftsq-bindning. Den knäppta slingan mellan 64-75-spiralen (rester 64-75) och 63-85-strängen (rester 83-85) lindas runt tyr248-återstoden av FtsQ (Fig. 2B). För att stabilisera den Kinkade slingkonformationen bildar fyra ftsb-rester (Glu68, Arg72, Arg79 och Glu82) ett kluster med omfattande saltbronätverk (Fig. 3A). Ftsb Glu68 bildar saltbryggor med både Arg72 (2,8 kg) och Arg79 (2,8 kg), medan Arg72 bildar en saltbrygga med Glu82 (2,8 kg och 3).0 oc, respektive; Fig. 3A); arg72 NH2-atomen bildar ytterligare en interaktion med Glu68 OE2-atomen (2,8 kcal; Fig. 3A). Saltbroklustret av FtsB är avgörande för vätebindningsbildning (2,7 KB) mellan syreatomen i FtsQ Tyr248 och NH1-atomen i FtsB Arg72 (Fig. 3A). Dessutom bildar Ftsb Glu69 en saltbrygga med FtsQ Arg196 (2,3 kcal; Fig. 3A). Intressant nog gör ftsb: s ftsb-sträng ett kontinuerligt ftsq-ark med FtsQ genom antiparallell stapling med ftsb12 (Fig. 2C). FtsB Phe84 bildar nära kontakter med FtsQ Tyr248, medan Tyr85 ligger i närheten av den hydrofoba kärnan i ftsq-domänen som består av Leu226, Leu230, Val254 och Trp256 (Fig. 2B). FtsB Leu87 bildar också omfattande kontakter med FtsQ Leu226 och den alifatiska delen av Arg222 (Fig. 2C).

Figur 3

molekylära interaktioner av FtsQB-komplexet i detalj. (A) förstorade vyer som visar detaljerade interaktioner vid ftsq-och FtsB-gränssnitten. Banddiagram över FtsB och ytdiagram över FtsQ visas. Röda ytor indikerar 100% konserverade rester av FtsQ (kompletterande Fig. S2). (B) representativa BLI-analyser av ftsq-FtsBL-komplex WT och mutanter (FtsQ Y248A, FtsB E68A, FtsB E69R, FtsB R72E och FtsB E82R). BLI sensorgram med olika koncentrationer av analyter indikeras av olika färger. Jämviktsanalys och beräknad KD visas för varje konstruktion vid högra paneler.

för att utvärdera bidragen från gränssnittsrester av FtsQB-komplexet muterades de gränssnittskonserverade resterna av FtsQ (Tyr248) och FtsB (Glu68, Glu69, Arg72 och Glu82) och deras interaktioner undersöktes av BLI. Bindningsaffiniteterna mellan FtsQ och FtsB mättes genom immobilisering av vildtyp (WT) eller mutanter av GST-e5-FtsB i komplex med k5-FtsL. Som förväntat resulterade mutation av gränssnittsresterna i stora minskningar av affinitet jämfört med WT (KD = 0,24 occurm). KD-värdet för y248a-mutanten kunde inte mätas på grund av svag bindning, medan E68A minskade affiniteten med ungefär 10 gånger (Fig. 3B). Laddningsomvandlingsmutationerna e69r, R72E och E82R av FtsB avskaffade nästan bindningen till FtsQ (Fig. 3B). Detta belyser ftsq Tyr248: s roll och ftsb: s motiv för ftsb som affinitetsdeterminanter.

ftsq och FtsB-gränssnitt in vivo

för att verifiera in vitro-bindningen av de periplasmiska regionerna av ftsb och FtsQ utförde vi en bakteriell tvåhybridanalys baserad på en cyklisk AMP-signaleringskaskade31. Eftersom N-terminal av T18 eller T25 smält Fts-protein var giftigt för E. coli och har en viss grad av instabilitetsproblem konstruerade vi C-terminus-smält Fts-proteiner (T25-FtsQ, T18-FtsB)18. E. coli bth101 reporter stam samtransformerades med ett par av indikerade plasmider och bindningseffektiviteten bestämdes genom analys av sackarios-galaktosidas (Fig. 4A). Såsom visas i Fig. 4A, WT FtsB och WT FtsQ interagerade med varandra. I liknande med bli-analysen kan FtsB (E68A) binda till WT FtsQ, medan bindningsaffiniteten reducerades ungefär två gånger jämfört med WT FtsB. De muterade proteinerna förutom FtsB (E68A) minskade deras förmåga att interagera med WT FtsQ. Det överensstämmer med in vitro-bindande resultat, vilket indikerar att gränssnittsresterna av FtsQ (Y248) och FtsB (E69, R72 och E82) spelar en viktig roll vid bildandet av FtsQB-komplexet.

Figur 4

molekylära interaktioner av ftsqb-komplexet in vivo. (A) effekten av mutationer vid gränssnittsresterna av FtsQ och FtsB. De angivna plasmidparen infördes i en reporter stam E. coli BTH101. Interaktionerna mellan FtsB och FtsQ bedömdes av det bakteriella tvåhybridsystemet. Bindningsaktiviteterna mättes med hjälp av en analys av den nya typen av oxid-galaktosidas och presenterades som Miller-enhet. B, ftsB; Q, ftsQ; * p < 0,05, **p < 0,005 jämfört med grupp som uttrycker T18 smält WT FtsB och T25 smält FtsQ-protein. (B) jämförelse av stabiliteten mellan WT och muterade proteiner. E. coli MG1655 som hyser plasmid pUHE21-2-lacIq som kodar för C-terminal His-märkt WT eller muterat protein samplades vid de angivna tidpunkterna efter tillsats av kloramfenikol och utsattes för Western blotting. DnaK användes som lastkontroll. C) in vivo-effekten av punktmutationer på FtsQ och FtsB. Funktionen av WT och muterade proteiner utvärderades med peptidkonjugerad PNA (PPNA). E. coli mg1655-stammar som hyser de angivna plasmiderna behandlades med PPNA, komplementära sekvenser i E. coli-kromosom men inte i de angivna plasmiderna. Cfu: er mättes efter 3 h PNA-behandling. Signifikanta CFU-skillnader indikeras jämfört med kontrollgrupp som uttrycker WT ftsB eller ftsQ. * p < 0,05,* * p < 0,005, N. S. inte signifikant jämfört med ftsB; # p < 0,05 jämfört med ftsQ; N. T. behandlas inte.

interaktionen mellan FtsQ och FtsB krävs för att rekrytera nedströms Fts-proteiner. När FtsQ eller FtsB tappas eller introduceras med skadlig mutation leder det till filamentering och så småningom celldöd. För att utvärdera in vivo-funktionen hos ftsqb-gränssnittsrester genomförde vi en viabilitetsanalys av celler som uttrycker WT eller muterade proteiner med peptidnukleinsyror (PNAs). En tidigare studie visade att peptidkonjugerade PNAs (PPNAs) riktade mot väsentliga gener hade bakteriedödande effekter på E. coli-celler32,33,34. Ribosombindningsställe är känt för att vara ett viktigt pna-målställe för att hämma translation32. Eftersom den snäva bindningen av PNA till mRNA stör ribosomfunktionen förhindras proteinöversättning 33. Baserat på dessa principer utformade vi fyra antisense ppna som kompletterar översättningsinitieringsplatserna för ftsB och ftsQ (kompletterande Fig. S4). Tillväxten av E. coli mg1655-stammen mättes för att undersöka de hämmande effekterna av antisense PPNA1, PPNA2, PPNA3 och PPNA4. ftsB-inriktning PPNA1 och ftsQ-inriktning PPNA3 hämmade starkt bakterietillväxt och filamentering av E. coli observerades (kompletterande Fig S4 och S5). Således använde vi PPNA1 och PPNA3 för ytterligare experiment. Vi konstruerade inducerbara plasmider som uttrycker WT FtsB, WT FtsQ, ftsb mutanter (E68A, E69R, R72E och E82R) och FtsQ mutant (Y248A). Eftersom de använda ppna: erna inte har några komplementära sekvenser till de rekombinanta plasmiderna, stör de inte proteinuttrycket i plasmider. Stammar som uttryckte WT eller muterade proteiner visade inga signifikanta skillnader i kolonibildande enheter (CFU) vid 3 h utan PPNA. Celler som uttrycker WT-proteinerna (FtsB eller FtsQ) i plasmid återhämtade bakterietillväxt när de behandlades med PPNA, men cellen som uttryckte det muterade proteinet återhämtade inte tillväxten förutom FtsB (E68A) (Fig. 4C). Filamentation observerades också i bakterier som uttryckte muterade proteiner som saknade förmågan att återhämta tillväxt när de behandlades med PPNA (kompletterande Fig. S5). För att utesluta en möjlighet att proteinstabiliteten kan påverka funktionen hos det muterade proteinet bestämde vi också in vivo proteinstabilitet genom att blockera de novo proteinsyntes. Plasmidkodningen FtsB eller FtsQ smält med sin tagg vid C-terminalen infördes i E. coli MG1655, och stabiliteten hos det muterade proteinet jämfördes med WT FtsB eller FtsQ (Fig. 4B och kompletterande Fig. S6). Som ett resultat visade de muterade proteinerna förutom FtsB (E68A) liknande resultat som WT. Även om FtsB (E68A) var instabil jämfört med WT FtsB, kan detta muterade protein FtsB (E68A) komplettera funktionen av WT FtsB och interagera med FtsQ. Sammantaget antyder det att mutationerna av gränssnittskonserverade rester av FtsQ (Y248) och FtsB (E69, R72 och E82) inte påverkar proteinstabiliteten utan avskaffar interaktionen mellan FtsB och FtsQ.

oligomera tillstånd av FtsQB och FtsQBL i lösning

tidigare rapporterades motstridiga resultat för ftsq-proteinets oligomera tillstånd. Dimerisering av FtsQ via dess transmembranregion (eller C-terminal 30-rester) observerades i ett bakteriellt tvåhybrid-experiment18,35. Däremot utfördes ett direkt experiment för att bestämma det oligomera tillståndet för FtsQ i lösning med användning av analytisk ultracentrifugering som indikerar att FtsQ är en monomer19. Vi kan emellertid inte utesluta möjligheten att transmembranregionen av FtsQ påverkar oligomeriseringstillståndet för FtsQ, eftersom det analytiska ultracentrifugeringsexperimentet utfördes med användning av den periplasmiska regionen av FtsQ19. Även om vi också använde de periplasmiska regionerna FtsQ, FtsQB och FtsQBL, antog vi att deras oligomera tillstånd i lösning beror på koncentrationen och att ytterligare oligomerisering kan uppstå vid höga koncentrationer. För att analysera de koncentrationsberoende oligomera tillstånden för FtsQ, FtsQB eller FtsQBL i lösning utfördes analytisk gelfiltrering med användning av en Superdex 200 (10/300 GL) kolonn och de experimentella Stokes-radierna (RH) jämfördes med de som beräknades från strukturmodeller (kompletterande Fig. S7). Strukturmodeller av FtsQ, FtsQB och FtsQBL för beräkning av RH-värden genererades baserat på vår kristallstruktur av FtsQB och SAXS struktur av FtsQBL som beskrivs nedan. De osynliga segmenten av n-och C-termini av FtsQ, FtsB och FtsL modellerades som flexibla slingor (kompletterande Fig. S7).

för höga och låga koncentrationer av FtsQ50-276 (respektive 370 respektive 18,5 kg) var den uppenbara RH (3,03 respektive 2,83 nm) närmare den teoretiska RH för ftsq50-276 monomer (2,90 nm), vilket tyder på att FtsQ huvudsakligen existerar som en monomer i lösning (Fig. 5). I motsats till ftsqb-komplexet var den skenbara RH (4,33 nm) närmare den för 2:2 ftsqb heterotetramer (4,87 nm) vid höga koncentrationer (138 kg), medan den skenbara RH (3,12 nm) var närmare den för 1:1 ftsqb heterodimer (3,49 nm) vid låga koncentrationer (8 kg; Fig. 5). För att ytterligare stödja 2:2 ftsqb heterotetramer-modellen mättes molekylvikten för FtsQB vid höga koncentrationer (138 oc-m) med storlek-uteslutning kromatografi med multi-vinkel ljusspridning (SEC-MALS). Faktum är att molekylmassan för FtsQB överensstämde med ett 2:2-komplex av FtsQ och FtsB (Fig. 1C). Dessa resultat tyder på att FtsB förmedlar dimerisering av FtsQB eftersom FtsQ existerar som en monomer vid höga och låga koncentrationer. För ftsqbl-komplexet eluerades heterohexamera och heterotrimera former separat vid gelfiltreringen under rening och de uppsamlades separat. Varje form var stabil som indikeras av sek-MALS (Fig. 1C), och vidare används för analys av analytisk gelfiltrering. Vid höga och låga koncentrationer av ftsqbl-komplexet (6,8-20 kg respektive 101-200 kg) var de uppenbara RH-värdena för heterohexamerisk FtsQBL närmare den för 2: 2:2 FtsQBL-modell (5,59 nm), medan RH-värdena för heterotrimerisk FtsQBL var närmare den för 1:1:1 FtsQBL-modellen (4,28 nm) (Fig. 5). Detta tyder på att både heterohexamera och heterotrimera former av FtsQBL existerar i en stabil form oberoende av dess koncentrationer.

Figur 5

koncentrationsberoende oligomerisering av FtsQ50–276 / FtsB25-103. (A) analytiska gelfiltreringsprofiler av FtsQ50–276 (lila), FtsQ50–276/FtsB25–103 (röd), ftsqbl heterotrimer (ljusgrön) och ftsqbl heterohexamer (mörkgrön) vid höga (101-370 occurm; heldragna linjer och vänster y-axel) och låga (6,8–20 occurm; streckade linjer och höger y-axel) koncentrationer. (B) sammanfattning av den hydrodynamiska analysen i Fig. 5A. RH-värden från kolumn jämfördes med de som beräknades från strukturmodeller (kompletterande Fig. S7) med hjälp av HYDROPRO program.

strukturell organisation av ftsqb tetramer

vi undersökte nästa strukturella organisation av ftsqb heterotetramer i lösning. När vi utvärderade kristallpackning av ftsqb-komplexet genererades en potentiell ftsqb heterotetramer genom kristallografiska symmetrioperationer och uppvisade en långsträckt struktur med övergripande dimensioner på 30 20 40 150 150, så att ftsqb heterodimer dimeriserades på ett antiparallellt huvud-till-huvud-sätt via n-terminalbauski-domäner av FtsQ-underenheter (kompletterande Fig. S7C). Även om vi spekulerade i att FtsQB bildar en större oligomer via FtsB baserat på analytisk gelfiltreringsdata, kunde vi inte utesluta möjligheten att ftsqb heterotetramer i lösning bildades av samma gränssnitt som observerades i kristallkontakten. Således undersökte vi om det kristallografiska gränssnittet är involverat i bildandet av ftsqb heterotetramer. Vid dimergränssnittet för FtsQ bildar strikt konserverade Leu57-och Phe87-rester en hydrofob kärna vid gränssnittet (kompletterande Fig. S2A); därför antog vi att ftsqb L57R eller F87A mutant existerar som en heterodimer oavsett dess koncentration om Leu57 och Phe87 är avgörande rester för montering av ftsqb heterotetramer. Men både l57r och F87A mutanter monterade i en 2: 2 heterotetramer endast vid höga koncentrationer (kompletterande Fig. S8), vilket tyder på att den observerade ftsqb heterotetramer i lösning inte bildades via de N-terminala Macau-domänerna för FtsQ-subenheter.

vi antog nästa att den spolade spolregionen av FtsB är ansvarig för dimeriseringen av ftsqb heterodimerer. I det här fallet förutspådde vi att en helixbrytande L46P-mutant av FtsQB hämmar dimerisering av ftsqb-heterodimerer. Faktum är att vissa delar av ftsqb L46P mutant samlas i 1: 1 heterodimerer, även vid höga koncentrationer (kompletterande Fig. S8). Dessa resultat tyder på att den lindade spolregionen av FtsB är avgörande för montering av ftsqb heterotetramer i lösning. I 2:2 ftsqb heterotetramer Modell, N-terminalriktningarna för båda FtsB-underenheterna är orienterade i samma riktning, och sålunda kan transmembranregionen av FtsB också dimerisera för att underlätta homodimerisering av ftsb i full längd. Detta kan förklara varför högre order oligomerisering av FtsQB observerades endast vid höga koncentrationer. I överensstämmelse med våra resultat rapporterade en tidigare studie att FtsB-self-associates via periplasmic coiled coil och transmembranregioner26. För höga och låga koncentrationer av e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (191 respektive 22,2 occurm), den uppenbara RH (båda 4.50 nm) var närmare den teoretiska RH för 2:2 heterotetramer av e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 (4,38 nm), vilket tyder på att e5-FtsB25–103/k5-FtsL64–121 huvudsakligen existerar som en heterotetramer i lösning (kompletterande Fig. S8). I överensstämmelse med detta visade en ny studie med FRET-analys och beräkningsmetoder också att FtsBL-komplexet bildar en tetramer36.

SAXS-strukturen för ftsqbl-komplexet

för att bestämma den totala konformationen av ftsqbl-komplexet i lösning samlades SAXS-data in. 1:1:1 eller 2:2:2 ftsqbl-komplex användes för att bestämma ab initio-strukturen hos molekylhöljet vid låga respektive höga koncentrationer (Fig. 6a och kompletterande Fig. S9). Intressant nog visade det övergripande kuvertet i ftsqbl 2: 2: 2-komplexet en långsträckt ”Y” – form (Fig. 6A). Även om kuvertet inte visade tillräckliga detaljer för att placera de enskilda domänerna FtsQ, FtsB och FtsL, observerade vi att det stora kuvertet med en konkav yta passade ganska bra med formen av FtsQ (Fig. 6A). För att införliva de två ftsq-molekylerna i det stora kuvertet med en konkav yta, bör N-terminala riktningarna för FtsQ och FtsBL vara motsatta. Detta var oväntat eftersom de tidigare modellerna som bildades av andra grupper hade N-terminala transmembranhelices orienterade i samma riktning20. Kristallstrukturen hos ftsq50–276 / FtsB25-103-komplexet införlivades framgångsrikt i molekylhöljet (Fig. 6a och kompletterande Fig. S9), vilket indikerar att den totala konformationen av ftsq50–276-FtsB25–103-komplexet är ganska styvt i lösning. Det extra kuvertet tilldelades positionerna för den heterotetramera spiralspolen och FtsBL e5 – och k5-spolarna (Fig. 6A). Det föreslogs nyligen att FtsBL-subkomplexet är en 2: 2 heterotetramer med en oavbruten FtsL-helix som förbinder transmembran och periplasmisk lindad spol36; därför kan den Y-formade FtsQBL passa väl in i det krökta membranet för membranförankring (Fig. 6B). På grund av den låga upplösningen av SAXS-kuvertet var det svårt att tydligt definiera strukturell montering av FtsQBL, därför krävs ytterligare strukturell bestämning. Även om vi observerade 2:2 ftsqb heterotetramer och 2: 2: 2 ftsqbl heterohexamerbildning in vitro, huruvida dessa former existerar in vivo förblir oklara och ytterligare studier krävs för att avslöja den fysiologiska stökiometrin hos divisomen. Det bör dock noteras att FtsQBL tidigare föreslogs att bilda ett 2:2:2-komplex vid divisome37. Även om ytterligare studier behövs för att fullt ut förstå strukturell organisation av FtsQBL i divisome assembly, ger våra data en grund för vidare utredning.

Figur 6

SAXS lösningsstruktur av FtsQBL och övergripande modell av ftsqbl-komplexet. (En) SAXS lösning strukturer av FtsQBL 1:1:1 trimer och 2:2:2 hexamer. Strukturella modeller av ftsqbl-komplexen (1: 1: 1 och 2: 2: 2) rekonstruerades med hjälp av ab initio-formbestämningsprogrammet DAMMIF. För varje protein genererades, jämfördes 10 oberoende modeller och en genomsnittlig modell beräknades med hjälp av programmet DAMAVER. Ytåtergivning av de strukturella modellerna uppnåddes med hjälp av programmet PyMOL. För att jämföra övergripande former och dimensioner, banddiagrammet för atommodellerna av FtsQBL-proteiner överlagrades på de rekonstruerade dummyatommodellerna med hjälp av programmet SUPCOMB. NSD = 7.039 för 1:1:1-modellen och 3.800 för 2: 2: 2-modellen. (B) övergripande modell av Y-formad FtsQBL. Ftsqbl-föreningen genom att rekrytera ftsbl-komplexet till FtsQ visas. Varje kedja är representerad i en annan färg.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.